Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu
2.2.5.2. Các bước thực hiện (Hình 2.6)
• Cho 50μl PBS vào các giếng từ cột số 2 cho đến cột số 12 trên plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc U).
• Cho 100μl mỗi dịch mẫu cần xác định hiệu giá virus vào các giếng ở cột 1.
• Thực hiện pha lỗng dịch mẫu theo bậc 2 cho các giếng từ cột 2 đến cột cuối cùng bằng cách hút 50μl dịch mẫu từ các giếng ở cột số 1 sang các giếng ở cột số 2, trộn đều, rồi hút 50μl dung dịch từ cột số 2 sang cột số 3,…
• Hút bỏ 50μl dung dịch ở cột cuối cùng.
• Bổ sung 50μl dung dịch hồng cầu gà 0,5% vào mỗi giếng.
• Giữ yên plate ở nhiệt độ phịng trong 30 – 45 phút.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2.2.6.1. Định nghĩa – Nguyên tắc
TCID50 (50% The Tissue Culture
giá virus dựa trên điểm tới hạn (end point) cho biết liều virus tại đĩ gây hủy hoại 50% số giếng tế bào [67]. Ví dụ: khi nĩi nồng độ virus trong thử nghiệm TCID50 là 103TCID50/0,1ml ghi nhận được sau 2 ngày thực hiện khảo sát cĩ nghĩa là ở nồng
Hình 2.6. Phương pháp thực hiện phản ứng HA trên plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc U).
50μl 50μl 50μl A B C D E F G H
•Giếng A1: dịch mẫu cần xác định hiệu giá virus. •Giếng A2 – A12: dịch mẫu lần lượt được pha lỗng bậc 2 (từ 1/2 – 1/2048) trong PBS.
2. Vật liệu – Phương pháp
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
33
ấy trên plate 96 giếng đáy bằng. Khi tế bào đã phủ đều
iá virus theo bậc 10 (10-1 – 10-10).
cần xác định hiệu giá virus đã được pha lỗng nĩi
CO2.
ng các giếng bằng cách quan
ết quả ngưng kết hồng cầu và tính TCID50 theo phương pháp Reed- (% dương tính trên 50) – 50 độ pha lỗng 1000 lần thì 0,1ml dịch virus này cĩ khả năng hủy hoại 50% tổng số giếng tế bào sau 2 ngày xâm nhiễm.
2.2.6.2. Các bước thực hiện
a. Chuẩn bị tế bào MDCK
Tế bào MDCK được nuơi c
lớp đơn (ngày 3 sau cấy chuyền) sẽ được sử dụng để xác định hiệu giá virus.
b. Chuẩn bị dịch mẫu cần xác định hiệu giá virus
Tiến hành pha lỗng dịch mẫu cần xác định hiệu g
c. Thực hiện TCID50 (Hình 2.7)
• Hút 200µl các dịch mẫu
trên vào các giếng tế bào (đã được rửa 2 lần bằng PBS) từ cột số 1 đến cột số 10, mỗi độ pha lỗng sử dụng 4 giếng theo cột dọc. Cột số 11 và 12 được dùng làm chứng âm (khơng chứa dịch mẫu) sẽ được bổ sung vào mỗi giếng tế bào 200µl mơi trường nuơi cấy virus.
• Ủ plate tế bào này trong tủ ấm 37oC, 5%
• Sau 72 giờ, xác định sự hiện diện của virus tro
sát hiệu ứng hủy hoại tế bào dưới kính hiển vi và kiểm tra khẳng định bằng phản ứng HA: chuyển 50µl dịch nổi trong mỗi giếng của plate tế bào chứa các dịch mẫu pha lỗng này sang 1 plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc U) sạch (giữ nguyên vị trí tương ứng của các giếng trên 2 plate), bổ sung 50µl dung dịch hồng cầu gà 0,5% vào mỗi giếng, để yên ở nhiệt độ phịng trong 30 – 45 phút.
• Đọc k
Muench [24]:
* Khoảng cách tỉ lệ = --- (% dương tính trên 50) – (% dương tính dưới 50)
khoảng cách tỷ lệ x hệ số pha lỗng
2.2.7. Xác định liều xâm nhiễm MOI
ợc định nghĩa là tỉ số giữa lượng tác nhân xâm
trong các flask T25cm2 với mật độ tế bào ban đầu và
mục 2.2.2.2.).
BRG- 121xp-E1 đã được xác định trước, liều xâm nhiễm và thể tích dịch virus cần
* Log âm TCID50/0,2ml = Log[độ pha lỗng đầu tiên dương trên 50%] +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H •Các giếng A1 – D10: dịch mẫu cần xác định hiệu giá virus lần lượt được pha lỗng bậc 10 (10-1 – 10-10).
•Các giếng A11 – D12: các giếng chứng âm (khơng chứa dịch mẫu).
Hình 2.7. Phương pháp thực hiện TCID50 trên plate 96 giếng đáy bằng.
2.2.7.1. Định nghĩa – Nguyên tắc
MOI (multiplicity of infection) đư
nhiễm (virus) và lượng mục tiêu xâm nhiễm (tế bào). Do đĩ, phương pháp xác định liều xâm nhiễm là phương pháp xác định lượng virus thích hợp nhất để đạt hiệu quả xâm nhiễm tế bào cao nhất [72].
2.2.7.2. Các bước thực hiện
Tế bào MDCK được nuơi cấy
thể tích mơi trường nuơi cấy bằng nhau. Khi lớp đơn tế bào đã phủ đều bề mặt nuơi cấy, các flask tế bào sẽ được sử dụng để khảo sát liều xâm nhiễm.
a. Với flask tế bào dùng để xác định số lượng tế bào
• Tiến hành đếm và tính số lượng tế bào như đã nêu trên (
2. Vật liệu – Phương pháp
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
35
Thể tích dịch virus cần dùng x hiệu giá TCID50/ml
--- (TCID50/cell)
ều xâm nhiễm
tính tốn như trên trong 60 phút, lắc (khơng virus) được ủ
hu nhận sau mỗi 24 giờ để theo dõi hiệu ứng CID50/ml này để xác định liều xâm nhiễm nào Lượng virus
MOI = --- [2] Lượng tế bào
= ---
Số tế bào
b. Với các flask tế bào dùng để khảo sát các li
• Ủ tế bào với virus NIBRG-121xp-E1 với các liều xâm nhiễm cần khảo sát và thể tích dịch virus cần sử dụng đã được
đều sau mỗi 15 phút. Flask tế bào dùng làm chứng âm với mơi trường nuơi cấy virus.
• Sau thời gian ủ, bổ sung vào mỗi flask khoảng 6ml mơi trường nuơi cấy virus rồi đặt vào tủ ấm 37oC.
• Mẫu dịch nuơi cấy virus được t
hủy hoại tế bào và xác định hiệu giá virus (HA và TCID50/ml). • So sánh các hiệu giá HA và T
3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10%FBS]
3.2. So sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2 thay đổi nồng độ FBS và CO2
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sĩt của tế bào MDCK của tế bào MDCK
3.4. Khảo sát nhiệt độ nuơi cấy thích hợp cho virus NIBRG-121xp-E1 3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1 3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1
3.6. Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 hạt Cytodex1
3.7. Ứng dụng các điều kiện nuơi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuơi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 nuơi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1
3. Kết quả - Biện luận 36
3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS]
3.1.1. Mục đích thí nghiệm
Xác định các pha tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng và thời gian nhân đơi quần thể của tế bào MDCK khi nuơi cấy trong mơi trường M0643 với 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 để làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.1.2. Mơ tả thí nghiệm
Từ ngân hàng tế bào trữ trong Nitơ lỏng -196oC, tế bào MDCK được rã đơng và cấy chuyền 3 đời trên mơi trường M0643, 10%FBS, 5%CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 (sử dụng flask T25cm2) để tế bào thích ứng và sinh trưởng ổn định.
Sau đĩ, tiếp tục sử dụng mơi trường nĩi trên, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các plate 12 giếng với mật độ là 2x105tế bào/giếng và thể tích mơi trường nuơi cấy là 2ml/giếng.
Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK được xây dựng thơng qua việc xác định số lượng tế bào theo thời gian: mỗi ngày đếm số tế bào sống ở 1 giếng và giá trị được thể hiện là giá trị trung bình của 4 lần đếm.
3.1.3. Kết quả – Biện luận
Dựa vào đồ thị đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS] (Hình 3.1), các pha tăng trưởng của tế bào MDCK được ngoại suy như sau:
• Từ 0 giờ đến 18 giờ: pha tiềm tàng. Tế bào thích ứng với mơi trường mới, bám dính vào bề mặt nuơi cấy và bắt đầu trải rộng.
• Từ 18 giờ đến 108 giờ: pha tăng trưởng. Tế bào sinh trưởng mạnh và số lượng tế bào tăng lên theo cấp số nhân.
• Sau 108 giờ: pha ổn định và suy tàn. Tế bào phủ kín bề mặt nuơi cấy. Tốc độ tăng trưởng giảm dần, số tế bào chết đi nhiều hơn số tế bào mới sinh ra nên tổng số tế bào giảm dần.
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 Thời gian T ổ ng s ố t ế b ào ( x10 5 ) NH = 1,9x106 NI = 0,3x106 t1 = 18 giờ t2 = 108 giờ
Hình 3.1.Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643. [5% CO2, 10% FBS]
Theo đĩ, các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS] cũng được xác định:
• Tốc độ phân chia: r = [3,32 x (logNH – logNI)] / (t2 – t1) = 0,0296 (tế bào/giờ)
• Thời gian nhân đơi quần thể: T = 1/r = 33,78 (giờ)
Khi bắt đầu tiến hành nuơi cấy 1 dịng tế bào thì việc xây dựng đường cong tăng trưởng, xác định các pha tăng trưởng cũng như các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào được thực hiện nhằm đánh giá khả năng thích ứng của tế bào với các điều kiện nuơi cấy cụ thể. Xây dựng đường cong tăng trưởng cũng là 1 phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tác động của các hormone, chất dinh dưỡng,... lên 1 dạng tế bào nhất định [26].
Mơi trường M0643 được chọn làm mơi trường tăng sinh tế bào MDCK trong điểu kiện phụ thuộc CO2 dựa theo kết quả hiệu suất nuơi cấy tế bào Vero của mơi trường này [4], [5]. Dựa vào đồ thị đường cong tăng trưởng, tốc độ phân chia r = 0,0296 tế bào/giờ, thời gian nhân đơi quần thể T = 33,78 giờ cũng như hình ảnh ghi nhận quá
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
38
trình phát triển của tế bào MDCK qua 7 ngày nuơi cấy trong mơi trường M0643 với 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 (Hình 3.2d), ta cĩ thể kết luận mơi trường và các điều kiện nuơi cấy này cũng rất thích hợp cho sự tăng sinh của tế bào MDCK: tế bào sinh trưởng rất nhanh, mạnh; số lượng tế bào thu được sau 5 ngày nuơi cấy tăng lên xấp xỉ 10 lần so với lượng tế bào cấy vào ban đầu. Từ 36 giờ đến 96 giờ sau cấy chuyền là khoảng thời gian thích hợp để thực hiện lần cấy chuyền tiếp theo hay tiến hành các thử nghiệm khác vì giai đoạn này tế bào trẻ và cĩ sức sống tốt.
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
40
3.2. So sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2
3.2.1. Mục tiêu thí nghiệm
So sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường M0643 và M1018 khi thay đổi nồng độ FBS và CO2 (với nhiệt độ nuơi cấy và pH mơi trường khơng đổi là 37oC và pH 7,2–7,4). Từ đĩ, cĩ thể lựa chọn thêm được các điều kiện nuơi cấy tốt khác cho tế bào MDCK.
3.2.2. Mơ tả thí nghiệm
Từ ngân hàng tế bào trữ trong Nitơ lỏng -196oC, tế bào MDCK được rã đơng và nuơi cấy trong mơi trường M0643, 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 qua 2 đời (sử dụng flask T25cm2) để tế bào hồi phục sức sống sau thời gian bảo quản.
Tiếp theo, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các mơi trường M0643 và M1018 với nồng độ FBS và CO2 khác nhau (Bảng 3.1). Việc cấy chuyền này được tiến hành qua 3 đời (sử dụng flask T25cm2) để tế bào thích ứng và sinh trưởng ổn định.
Bảng 3.1. Nồng độ FBS và CO2 dùng để so sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong mơi trường M0643 và M1018.
Mơi trường Nồng độ FBS Nồng độ CO2 Nhiệt độ nuơi cấy pH mơi trường M0643 5% 5% 37oC 7,2–7,4 M1018 10% 0% 37oC 7,2–7,4 M1018 5% 0% 37oC 7,2–7,4
Sau đĩ, tiếp tục sử dụng các mơi trường như ở Bảng 3.1, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các plate 12 giếng với mật độ là 2x105tế bào/giếng và thể tích mơi trường nuơi cấy là 2ml/giếng.
Hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK của các mơi trường thí nghiệm được đánh giá dựa trên số lượng tế bào thu được theo thời gian: mỗi ngày đếm số tế bào sống ở một giếng đối với từng loại mơi trường và giá trị được thể hiện là giá trị trung bình của 4 lần đếm.
3.2.3. Kết quả – Biện luận
Hình 3.3. Hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK của các mơi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 T ổ ng s ố t ế bà o ( x1 0 5 )
ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 Thời gian M1018 0% CO2 5% FBS M1018 0% CO2 10% FBS M0643 5% CO2 5% FBS
Các kết quả trên đồ thị thể hiện số tế bào thu được theo thời gian khi nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường M0643 và M1018 với nồng độ FBS và CO2 khác nhau (Hình 3.3) cho thấy:
• Mơi trường M1018 [0% CO2, 5% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy thấp nhất. Số lượng tế bào tăng lên rất ít qua từng ngày nuơi cấy, đỉnh điểm của sự tăng trưởng với số tế bào thu được là 4,94x105 chỉ cao gấp 2,5 lần so với lượng tế bào cấy vào ban đầu.
• Mơi trường M0643 [5% CO2, 5% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy trung bình với lượng tế bào thu được tăng lên khoảng 5 lần sau 5 ngày nuơi cấy.
• Mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy cao nhất. Số tế bào thu được qua từng ngày nuơi cấy đều cao vượt trội so với 2 mơi trường cịn lại. Tại đỉnh điểm của sự tăng trưởng (ở ngày nuơi cấy thứ 5), tổng sinh khối tế bào đã tăng hơn 7 lần so với số tế bào cấy vào ban đầu.
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
42
Thêm vào đĩ, hình ảnh ghi nhận quá trình tăng trưởng của tế bào MDCK qua 7 ngày nuơi cấy trong các mơi trường thí nghiệm (Hình 3.2a, b, c) cũng cho thấy rõ hiệu quả nuơi cấy tốt nhất của mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] với các tế bào mọc dày, sát khít vào nhau và phủ kín bề mặt nuơi cấy, trong khi tế bào cĩ phần thưa hơn trong mơi trường M0643 [5% CO2, 5% FBS] và khơng phủ kín được bề mặt nuơi cấy trong mơi trường M1018 [0% CO2, 5% FBS].
Mơi trường M1018 được chọn thử nghiệm tăng sinh tế bào MDCK trong điều kiện khơng phụ thuộc CO2 dựa theo kết quả hiệu suất nuơi cấy tế bào Vero của mơi trường này [4], [5]. Với các kết quả ghi nhận được từ thí nghiệm 3.1 và 3.2, chúng tơi nhận thấy nồng độ 10% FBS cho hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK tốt hơn so với 5% FBS trong cả điều kiện cĩ và khơng cĩ CO2. Tuy nhiên, Yung-Chih cùng cộng sự (2008) đã sử dụng nồng độ 5% FBS (chi tiết về nồng độ CO2 khơng được cơng bố) [57] và Murakami cùng cộng sự (2008) đã sử dụng nồng độ 5% FBS, 5% CO2 [27] để tạo ngân hàng tế bào MDCK.
Từ kết quả trên, chúng tơi tiến hành dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] dựa vào số tế bào thu được theo thời gian (Hình 3.4). Các pha tăng trưởng của tế bào được ngoại suy như sau:
• Từ 0 giờ đến 24 giờ: pha tiềm tàng.
• Từ 24 giờ đến 108 giờ: pha tăng trưởng.