2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5 Tình hình nghiên cứu về phương pháp nhân giống vô tắnh bằng giâm cành
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới hình thức nhân giống vô tắnh bằng phương pháp giâm cành ựã ựược nghiên cứu từ rất sớm như: ở Trung Quốc bắt ựầu nghiên cứu từ năm 1900, ở Ấn độ năm 1911, ở Gruzia năm 1928, Nhật Bản năm 1936, Srilanka năm 1938)[1]. đặc biệt từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi mà công nghệ hóa học phát triển mạnh mẽ, con người ựã tổng hợp ựược nhiều dạng auxin ngoại sinh khác nhau và ựem nó sử dụng trong kỹ thuật giâm cành. Nhờ vậy, ựã biến giâm cành trở thành một phương pháp nhân giống phổ biến và ứng dụng rộng rãi mang tắnh công nghiệp, sản xuất hàng loạt với quy mô lớn [13].
Theo Mary Weich - Keesey và B.Rosie Lemer (2006) thì sử dụng auxin ựể kắch thắch sự hình thành rễ sẽ nâng cao tỷ lệ hình thành câỵ Hai hợp chất thường ựược sử dụng thường xuyên nhất là IBA và α-NAẠ đối với cây thân thảo và thân gỗ mềm thì sử dụng ở nồng ựộ <1000ppm (0,1%), cây thân gỗ nửa cứng thì sử dụng ở nồng ựộ 3000ppm (0,3%), còn cây thân gỗ cứng thì sử dụng nồng ựộ là 8000ppm (0,8%) [21].
- để tất cả năng lượng tập trung nuôi rễ mới hình thành của hom giâm thì phải cắt hết hoa và quả trên hom nếu không chúng sẽ sử dụng phần lơn năng lượng của hom giâm.
- Trong quá trình giâm cành ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp nhất là 18,3 - 23,90C, tránh ựể quá nóng hoặc quá lạnh.
- Khi giâm phải ựặt dưới cường ựộ ánh sáng nhẹ, không ựể dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp quá gay gắt.
- độ dài của hom giâm là 5 - 15 cm tùy loại câỵ
- để hạn chế sự mất nước của hom giâm thì tuốt bỏ hoặc căt 1/2 Ờ 2/3 lá [21].
Những nghiên cứu của C.J.Hansen (1958); Hartmanm, W.H.Grigss, C.J.Hansen (1963) và cộng sự cho rằng: mùa giâm cành trong năm như một yếu tố chìa khóa quyết ựinh sự thành công của quá trình nhân giống và có những kết luận sau: ựối với các loại cây rụng lá, gỗ cứng thường lấy cành giâm vào giai ựoạn cây bước vào thời kỳ ngủ nghỉ còn ựối với các cây gỗ mềm, nủa cứng không rụng lá, cây thân thảo thì nên lấy cành giâm vào mùa sinh trưởng.
S.H.Freeman (1960) khi nghiên cứu về ựiều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng ựến sự ra rễ của cành giâm ựã cho kết luận như sau:
- Về ánh sáng: Ánh sáng ức chế sự phát sinh hình thành rễ, duy trì sự thiếu hụt ánh sáng sẽ kắch thắch sự ra rễ. để xúc tiến quá trình ra rễ có thể sử dụng các vật liệu che phủ mờ ựục như: nilon ựen, trắng, lưới ựen, lá khô, rơm rạẦ ựể làm giảm cường ựộ ánh sáng tác ựộng lên cành giâm. Sự suy yếu ánh sáng có thể ảnh hưởng ựến sự tập trung auxin và những chất khác dễ bị phân hủy bởi ánh sáng mạnh.
- Về nhiệt ựộ: Nhiệt ựộ không khắ ở mức vừa phải từ 20 - 260C sẽ làm giảm bớt sự hô hấp của cành giâm, giảm sự tiêu hao năng lượng ựồng thời
ức chế quá trình hình thành rễ. Vì vậy, ựảm bảo ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp là rất quan trọng trong quá trình giâm cành.
- Về ẩm ựộ: độ ẩm thấp là nguyên nhân dẫn ựến sự khô héo của cành giâm, gây nên sự thất bại trong quá trình giâm cành. Chắnh vì vậy, việc ựảm bảo ựộ ẩm không khắ luôn ở mức bão hòa bằng phương pháp phun mù, phun mù gián ựoạn rất có ý nghĩa trong quá trình giâm cành.
Theo Jean Miche (1977), việc sử dụng phương pháp xông hơi nóng ựể duy trì nhiệt ựộ ở vùng rễ khoảng 25,40C làm cho quá trình ra rễ ựược thuận lợi vì nó kắch thắch sự phân chia tế bào, phần ở trên không khắ có thể ở ựiều kiện mát, làm giảm sự thoát hơi nước và giảm bớt hô hấp. Nhiệt ựộ ban ngày khoảng 21 - 26,70C là thuận lợi cho quá trình ra rễ của phần lớn các cây [13].
2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nhân giống bằng phương pháp giâm cành cũng ựã ựược nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất ựối với rất nhiều loại cây trồng như: cam, chanh, quất, cúc, ựàoẦ
Kết quả nghiên cứu của bộ môn Rau - Quả trường đH Nông nghiệp Hà Nội từ những năm 1976 cho thấy:
- Giâm cành trong vụ xuân hè và vụ thu nên dùng giá thể là cát sông sạch với ựiều kiện ánh sáng trực xạ và giữ ẩm mặt lá cành giâm.
- Những loại cây ăn quả giâm cành tương ựối thuận lợi như: chanh ta, chanh Eureka, chanh yên, dâu ăn quả, quất, mận [13].
Trong nhiều năm qua, phòng thắ nghiệm của bộ môn Sinh lý thực vật trường đH Nông nghiệp Hà Nội ựã tập trung nghiên cứu cơ sở sinh lý của sự tái sinh rễ ở cành giâm. đã ứng dụng vào kỹ thuật nhân giống vô tắnh bằng phương pháp giâm cành cho nhiều ựối tượng cây trồng khác nhaụ Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng auxin ngoại sinh ựã kắch thắch sự ra rễ của cành giâm, phương pháp xử lý nhanh, nồng ựộ cao (4000 - 6000) là cho hiệu quả cao hơn
cả, ánh sáng tán xạ, ựộ ẩm bão hòa là ựiều kiện tối ưu cho sự ra rễ của cành giâm [13].
Theo Hoàng Ngọc Thuận (2000):
Lấy cành giâm là những cành bánh tẻ có thể non hơn hoặc già hơn tùy chủng loạị Nên loại bỏ những cành sâu bệnh hạị Cành phải cắt vào thời gian không có nắng. Nếu gặp trời nắng hanh hoặc nắng nóng thì sau khi cắt cành ra khỏi cây phải phun nước ngay rồi mới ựưa vào chỗ mát ựể sửa cành và xử lý. Nhiệt ựộ thắch hợp cho sự ra rễ của nhiều loại cây trồng là 21,6 - 26,50C [15][16].
đặng Văn đông và đinh Thế Lộc (2003) ựã chỉ ra rằng:
Giá thể giâm cây hoa cúc có thể là ựất phù sa, ựất thịt nhẹ hay ựất bùn ao, nhưng qua các kết quả thắ nghiệm cho thấy tốt nhất là chọn cát sạch. Chọn cành bánh tẻ, chiều dài hom giâm là 6 - 8 cm, có khoảng 3 - 4 lá/hom. Các lá trên cành xanh tốt, không bị sâu bệnh, sức sống cành giâm khỏẹ Mật ựộ giâm phụ thuộc vào giống và thời vụ. Có thể là 1000 hom/m2 ựối với những cành to khỏe, lá nhiều và 1600 hom/m2 ựối với những giông cành nhỏ, ắt lá. Mùa thu nên giâm dày hơn mùa hè [3].
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của số ựốt trên hom giâm ựến khả năng ra rễ của hom Saphia, Nguyễn Mai Thơm và Vũ Văn Liết (2003) ựã chỉ ra rằng: hom có 3 ựốt và hom có 4 ựốt cho tỷ lệ sống cao nhất. Hai tác giả này cũng nhận thấy thời vụ giâm cành có ảnh hưởng rất lớn ựến khả năng nhân giống cây cảnh Saphiạ Thời vụ nhân giống thắch hợp nhất là từ 15/3 - 20/3 và sử dụng hom giữa, hom gốc cho tỷ lệ ra rễ cao, sinh trưởng của hom giâm là tốt nhất [12].
Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì ở nước ta thời vụ giâm cành tốt nhất là vụ xuân (10/2 - 20/4) và vụ thu (20/9 - 20/10).
kiện sản xuất ở Việt Nam. Nghiên cứu của Trần đình Long và cộng sự chỉ ra rằng:
- Cành Cỏ ngọt ựược sử dụng ựể nhân giống nên lấy ở cây mẹ từ 4 tháng ựến 1 năm tuổi là tốt nhất.
- Giâm trên môi trường cát, ựất và bùn ao cho tỷ lệ ra rễ sớm nhất và cao nhất. Tuy nhiên, giâm trên môi trường cát sẽ thuận lợi cho nhân giống ựại trà và cho hiệu quả kinh tế cao hơn. Giâm trên ựất và bùn ao cho cây con cứng cáp, bộ rễ phát triển mạnh nhưng chi phắ cao và tốn nhiều công trong quá trình nhổ cây con ựồng thời gây bất tiện khi phải vận chuyển ựi xạ Trong những thời gian nóng bức, nhiệt ựộ, ựộ ẩm không khắ cao, giâm trên bùn ao cho tỷ lệ cây sống cao và chất lượng cây giống khỏe (Trần đình Long và CS,1996) [4].
- đối với việc sử dụng chất ựiều hòa sinh trưởng, α-NAA là có hiệu lực cao nhất trong việc kắch thắch ra rễ cành giâm và thời gian ra rễ ngắn nhất. Nồng ựộ α-NAA thắch hợp nhất cho cây ra rễ là 30 - 50ppm (trong ựiều kiện nhân giống vào mùa hè) và từ 150 - 200 ppm (trong ựiều kiện nhân giống vào mùa ựông giá rét). (Trần đình Long và CS,1996) [4].
2.6. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ựịnh dưới tác ựộng của auxin
Trong sự hình thành rễ, ựặc biệt là rrễ bất ựịnh, auxin có tác dụng rất ựặc biệt, vì vậy có khi người ta xem auxin là chất hình thành rễ.
Sự hình thành rễ bất ựịnh của cành chiết, cành giâm có thể chia làm ba giai ựoạn:
- đầu tiên là sự phản phân hoá tế bào mạnh mẽ ở vùng tiền thượng tầng, trụ bìẦ, nơi xuất phát của rễ bất ựịnh, thành một ựám tế bào lộn xộn.
- Giai ựoạn tiếp theo là xuất hiện mầm rễ.
- Cuối cùng, rễ sinh trưởng, ựâm thủng vỏ và kéo dài thành các rễ bất ựịnh. Trong 3 giai ựoạn trên thì giai ựoạn ựầu, giai ựoạn khởi xuơngswj hình
ựoạn sau cần hàm lượng thấp hơn và ựôi khi không cần. Nguồn auxin có thể là nguồn nội sinh và cũng có thể do bổ sung từ ngoài vàọ Thường ựể xúc tiến quá trình hình thành rễ nhanh chóng ở cành chiết, cành giâm, người ta thường xử lý auxin ngoại sinh như : IBA, IPA, α-NAA, 2,4DẦ [11].
Vai trò của Auxin ựối với sự hình thành rễ ựược chứng minh rõ trong nuôi cấy mô tế bàọ Nếu chỉ có mặt của auxin trong môi trường nuôi cấy, mô chỉ phát sinh rễ mà thôị để tạo cây hoàn chỉnh thì cần phải có chồi nữa, tức phải bổ sung xytokynin vào môi trường nuôi cấy [11].
Có 3 phương pháp ựể xử lý auxin cho sự ra rễ bất ựịnh:
- Phương pháp xử lý nồng ựộ loãng: nồng ựộ xử lý vài chục ppm. Với phương pháp giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch trong thời gian 12 Ờ 24h rồi cắm cành giâm vào giá thể.
Với phương pháp chiết cành thì trộn dung dịch xử lý với ựất bó bầu trước khi bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ [8].
- Phương pháp xử lý nồng ựộ ựặc: Nồng ựộ xử lý khoảng vài nghìn ppm.
Với phương thức giâm cành thì nhúng rất nhanh phần gốc vào dung dịch trong khoảng 1-2 giây rồi cắm vào giá thể [8].
Với phương thức chiết cành thì dùng bông tẩm dung dịch xử lý và chỉ cần bôi lên trên vết khoanh vỏ trước khi bó bầụ
- Sử dụng dạng bột: có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, trong thành phần có chứa auxin với một tỷ lệ nhất ựịnh ựược phối trộn với loại bột nào ựó, khi giâm cành chỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào chế phẩm bột rỗi cắm vào giá thể [8].
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 đối tượng nghiên cứu
Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni), giống Morita 3 (M3) của tập ựoàn Pure Circle (Mỹ), tập ựoàn hàng ựầu thế giới về cây cỏ ngọt. Giống ựược công ty CP Stevia Ventures nhập nội và phân phối trên toàn quốc.
Giống cỏ ngọt M3 có dạng thân bụi, chiều cao 60-70 cm, thâm canh tốt có thể ựạt 80-90 cm, phân cành cấp một nhiềụ Lá mọc ựối từng cặp hình thập tự hoặc mọc cách, mép lá có từ 12-16 răng cưa, lá hình trứng ngược, lá trưởng thành dài khoảng 50-70 mm, rộng 17-20 mm. Hoa phức, giao phấn, khả năng tự thụ phấn thấp. Quả mầu nâu thẫm, năm cạnh khi chắn dài 2-2,5 mm, hạt có rất ắt nội nhũ. Cây con gieo từ hạt sinh trưởng chậm.
Thời gian từ khi trồng ựến thu hoạch từ 45-60 ngày, hàm lượng ựường tổng số Steviol glucoside >12%, trong ựó hàm lượng Rebaudioside A (Reb A) >60%. Reb A là chất ngọt chắnh trong cây cỏ ngọt, không mang năng lượng và ở ựộ tinh khiết 98% thì ngọt gấp ựường mắa 350-400 lần.
3.1.2 Vật liệu nghiên cứu
* Giá thể:
- Trấu hun: vỏ trấu ựem hun cháy trong ựiều kiện hiếm khắ nên cháy không hoàn toàn, có tắnh thoát nước, thông thoáng, nhẹ, tạo ựộ tơi xốp cho giá thể và không làm thay ựổi pH của giá thể.
- Xơ dừa: trước khi sử dụng cần ngâm nước ựể xơ dừa mềm ựồng thời loại bỏ các chất ựộc tố. Xơ dừa cũng có tác dụng tạo ựộ tơi xốp, thông thoáng cho giá thể.
* Hoá chất:
- Naphtalein axetic axit (α-NAA) là Auxin ngoại sinh có tác dụng kắch thắch cành giâm ra rễ.
- Một số chế phẩm ra rễ:
+ Chế phẩm Pisomix-Y15 (công ty YAMADA CỌ,LDT).
+ Chế phẩm giâm chiết cành MD.910 (công ty CP sinh hóa Minh đức). + Chế phẩm Bimix (công ty CP cây trồng Bình Chánh).
* Vật tư:
- Khay giâm: dùng khay xốp có ựục lỗ ở ựáy ựể thoát nước - Giầm, bình tưới nước và phun thuốc....
3.1.3 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
Thắ nghiệm ựược tiến hành trong thời gian từ tháng 5 năm 2011 ựến tháng 3 năm 2012 trong nhà lưới có mái che tại khu thắ nghiệm khoa Nông học - trường đH Nông nghiệp Hà Nộị
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ α-NAA ựến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế phẩm ra rễ ựến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ựến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ựến sự ra rễ của cành giâm cây cỏ ngọt giống Morita 3.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
* Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng ựộ α-NAA ựến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt.
- Công thức thắ nghiệm:
Thắ nghiệm ựược bố trắ 5 công thức với 4 công thức thắ nghiệm ứng với nồng ựộ α-NAA khác nhau và 1 công thức ựối chứng (nước sạch).
CT1 (ự/c) : Nước sạch CT2 : α-NAA 1000ppm CT3 : α-NAA 1500ppm CT4 : α-NAA 2000ppm CT5 : α-NAA 2500ppm - Nền giá thể là: cát ẩm, ựã xử lý thuốc phòng nấm bệnh phổ rộng.
- Cách xử lý: nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch α-NAA trong khoảng thời gian 3-5 giây rồi nhấc ra và cắm hom giâm vào giá thể ựã chuẩn bị sẵn.
- Thời gian thắ nghiệm: tháng 8/2011
* Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của một số chế phẩm giâm chiết cành ựến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển và chất lượng của cành giâm cây cỏ ngọt.
- Công thức thắ nghiệm:
Thắ nghiệm ựược bố trắ 5 công thức với 4 công thức thắ nghiệm là 4 loại chế phẩm giâm chiết cành khác nhau và một công thức ựối chứng (nước sạch).
CT1 (ự/c) : Nước sạch
CT2 : α-NAA 1500ppm
CT3 : Pisomix-Y15 của công ty YAMADA CỌ,LDT CT4 : Bimix của công ty cây trồng Bình Chánh - TP HCM CT5 : MD.901 của công ty CP sinh hóa Minh đức
- Nền giá thể là: cát ẩm, ựã xử lý thuốc phòng nấm bệnh phổ rộng.
- Cách xử lý:
+ đối với α-NAA: nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch α- NAA trong khoảng thời gian 3-5 giây rồi nhấc ra và cắm hom giâm vào giá thể ựã chuẩn bị sẵn.
+ đối với các chế phẩm khác: pha dung dịch với nồng ựộ ựã ựược hướng dẫn sẵn ghi trên bao bì (với ựối tượng cành giâm là loài thân thảo). Nhúng phần gốc của hom giâm vào dung dịch ựã pha sẵn (theo chỉ dẫn của nhà sản xuất) rồi cắm hom giâm vào giá thể ựã chuẩn bị sẵn.
- Thời gian thắ nghiệm: tháng 11/2011