2.2.1. đối tượng nghiên cứu
- Chủng virus Newcastle cường ựộc VN91 ựược lưu giữ tại TTKNTTYTW1.
- Vacxin Avipro ND Lasota nhược ựộc, ựông khô do Lohmann Animal Health GmbH & Cọ KG, Germany sản xuất.
2.2.2. Các trang thiết bị và cơ sở vật chất
Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của phòng Virus - Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, Cục Thú ỵ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
2.2.3. địa ựiểm nghiên cứu
- Phòng Virus Ờ Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương Ị - Trại gà của bà Lê Thị Mơ Ờ Thị trấn Phùng Ờ đan Phượng Ờ Hà Nộị
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp kiểm tra ựộ vô trùng của giống
Giống virus Newcastle cường ựộc VN91 ựược kiểm tra vô trùng theo 10TCN 161 Ờ 92 ỘQuy trình kiểm tra vô trùngỢ (Cục thú y, 1994) [2].
Giống virus ựông khô, ựược hoàn nguyên trở lại bằng nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS vô trùng.
Cấy huyễn dịch virus giống (lượng cấy kiểm tra bằng 1 Ờ 2% dung tắch môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịtvà nước thịt gan yếm khắ, mỗi loại 2 ống. Môi trường ựã cấy kiểm tra ựược theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng (25 Ờ 300C).
2.3.2. Phương pháp kiểm tra ựộ thuần khiết của giống
* Kiểm tra tạp nhiễm mycoplasma
- Tiến hành
Giống ựược cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng ựộ từ 1-2% giống ựã pha loãng trong 100ml môi trường và trên ựĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tắch 0,1ml kháng thể trên 1 ựĩạ
Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt ựộ từ 33-37oC. Tại các thời ựiểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 ựĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 ở 37oC có 5% khắ CO2, theo dõi trong 28 ngàỵ Kết quả: Mẫu giống ựược xem là ựạt khi không có khuẩn lạc mycoplasma mọc trên môi trường kiểm trạ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
* Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella
- Tiến hành nuôi cấy
Mẫu giống ựã pha ựược cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại môi trường sau: Thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, với nồng ựộ từ 1-2% dung tắch môi trường kiểm trạ
Ủ môi trường ựã cấy giống trong tủ ở 37oC, theo dõi từ 18h-24h sau ựó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: Canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat. Ủ trong tủ ở 37oC, theo dõi từ 48h-72h.
- đọc kết quả
Giống ựược xem là ựạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm trạ
2.3.3. Phương pháp gây nhiễm virus Newcastle cường ựộc chủng VN91 vào xoang niệu nang phôi gà ấp 9 Ờ 11 ngày tuổi vào xoang niệu nang phôi gà ấp 9 Ờ 11 ngày tuổi
Trứng gà Leghorn có phôi ựược lau sạch, ấp ở nhiệt ựộ 38 ổ 0,50C, sau 5 ngày soi loại những quả vô tinh và chết phôị đến ngày thứ 10, tiếp tục soi loại những quả bị chết phôi, ựánh dấu vị trắ buồng hơi và ựầu phôị
Giống virus ựông khô, ựược pha loãng bằng nước muối sinh lý hoặc PBS vô trùng.
Gây nhiễm vào xoang niệu nang mỗi trứng 0,1ml huyễn dịch giống virus ựã pha loãng. Hàn kắn lỗ tiêm, ấp tiếp ở nhiệt ựộ 370C. Hàng ngày soi trứng, kiểm tra sự phát triển của phôị Những phôi chết trước 24 giờ sau khi gây nhiễm ựược loại bỏ. Những quả chết phôi sau 24 giờ gây nhiễm ựược bảo quản tủ lạnh dương (2 Ờ 80C) chờ thu hoạch. Thời gian theo dõi là 5 ngày (120 giờ).
Thu hoạch nước niệu nang, kiểm tra vô trùng và bệnh tắch phôị
Trong thời gian kiểm tra phải bảo quản nước niệu nang trong tủ lạnh âm sâu (- 500C).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
2.3.4. Phương pháp chuẩn ựộ virus
Phương pháp chuẩn ựộ virus Newcastle cường ựộc trên phôi gà ựược tiến hành như sau:
- Hoàn nguyên lọ giống ựông khô bằng PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) vô trùng.
- Dùng PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 ựể có dãy nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-11 .
- Gây nhiễm virus ở các nồng ựộ ựã pha loãng vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi ấp 9 Ờ 11 ngày tuổi, mỗi ựộ pha loãng 5 quả, mỗi quả 0,1 ml.
- 5 quả trứng có phôi tiêm nước muối sinh lý làm ựối chứng.
- Hàn kắn lỗ tiêm bằng parafin, ấp tiếp ở nhiệt ựộ 370C, theo dõi liên tục trong 7 ngàỵ Hàng ngày soi trứng, theo dõi sự phát triển của phôị Những quả phôi chết ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 2 Ờ 80C.
-Tắnh toán liều gây nhiễm 50% (ELD50) theo phương pháp của Reed Ờ Muench, 1938.
2.3.5. Phương pháp lựa chọn gà thắ nghiệm
Lựa chọn những gà thắ nghiệm phải khỏe mạnh, có nguồn gốc từ ựàn gà bố mẹ khỏe mạnh, không tiêm phòng bất kể vacxin nàọ Gà ựược lấy máu và kiểm tra hiệu giá kháng thể Newcastle bằng phản ứng HI trước khi tiến hành thắ nghiệm (HGKT ≥ 3 log2 dương tắnh).
2.3.6. Phương pháp xác ựịnh thời gian chết phôi trung bình (MDT)
Giống virus Newcastle cường ựộc chủng VN91 ựược bảo quản dưới dạng ựông khô ở nhiệt ựộ -500C. Giống ựược hoàn nguyên trở lại bằng nước muối sinh lý hoặc PBS vô trùng và pha loãng theo cơ số 10 từ 10-1 Ờ 10-11. Mỗi ựộ pha loãng tiêm vào xoang niệu nang của 5 phôi gà ấp 9 Ờ 11 ngày tuổi, mỗi quả 0,1 ml. 5 phôi ựối chứng không tiêm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Thời gian gây chết phôi trung bình (MDT): Là thời gian trung bình ựể liều tối thiểu gây chết 100% số phôi và ựược tắnh theo công thức
X = n h h h h1 + 2 + 3 + ... + n Trong ựó: X : Giá trị của MDT
h1,..., hn : Thời gian gây chết phôi n: Tổng số phôi nghiên cứu
2.3.7. Phương pháp xác ựịnh chỉ số gây bệnh khi tiêm não gà con 1 ngày tuổi
Sử dụng nước trứng tươi ựã gây nhiễm virus Newcastle cường ựộc chủng VN91 tiêm vào não cho 10 gà con 1 ngày có nguồn gốc từ ựàn gà sạch bệnh, mỗi con 0,05 ml. 10 gà ựối chứng không tiêm. Gà sau khi tiêm ựược kiểm tra hàng ngày, liên tục trong 8 ngày, ghi lại số gà khoẻ, ốm, chết.
Ở các ngày theo dõi:
- Gà bình thường ựược ghi 0 ựiểm. - Gà ốm ghi 1 ựiểm.
- Gà chết ghi 2 ựiểm
2.3.8. Phương pháp xác ựịnh chỉ số gây bệnh khi tiêm tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi (IVPI)
Chỉ số gây bệnh khi tiêm virus Newcastle cường ựộc chủng VN91 vào tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi ựược tiến hành theo phương pháp của Alexander và Parsons, 1984. Sử dụng nước trứng tươi ựã gây nhiễm virus Newcastle cường ựộc chủng VN91 ựược pha với PBS vô trùng thành huyễn dịch 1/10, tiêm 0,1ml vào tĩnh mạch cho 10 gà 6 tuần tuổị Gà ựối chứng không tiêm.
Gà sau khi tiêm ựược theo dõi hàng ngày, liên tục trong 8 ngày, ghi chép và ựánh giá tình trạng sức khoẻ ựàn gà.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 + Bình thường : 0 ựiểm
+ Ốm : 1 ựiểm + Liệt : 2 ựiểm + Chết : 3 ựiểm
2.3.9. Phương pháp xác ựịnh liều gây chết 50% ựộng vật thắ nghiệm (LD50)
- Gà Lương Phượng, khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin Newcastlẹ - Hoàn nguyên lọ giống ựông khô bằng PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) vô trùng. Dùng PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) pha loãng virus theo cơ số 10 ựể có dãy nồng ựộ từ 10-1 ựến 10-10 .
- Tiêm bắp cho mỗi gà 1ml huyễn dịch virus pha loãng ở các nồng ựộ. Mỗi nồng ựộ tiêm cho 5 gà. 5 gà ựối chứng không tiêm. Sau ựó theo dõi, ghi lại số gà phát bệnh và chết trong vòng 8 ngày ở từng nồng ựộ tiêm và tắnh LD50 theo phương pháp Reed-Muench, (1938).
2.3.10. Phương pháp khảo nghiệm vacxin
* Bố trắ thắ nghiệm:
Sử dụng 500 gà Lương phượng 7 ngày tuổi và chia làm 3 lô ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bố trắ thắ nghiệm khảo nghiệm vacxin Avipro ND Lasota
Lô thắ nghiệm
Số con mỗi lô
Liều vắc xin và
ựường cấp thuốc Ghi chú
Lô 1 100 Không dùng vắc xin đối chứng
Lô 2 50 10 liều quy ựịnh; nhỏ mắt An toàn
Lô 3 350 1 liều quy ựịnh; nhỏ mắt Miễn dịch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 Trước khi gà ựược nhỏ vacxin, lấy mẫu máu ngẫu nhiên 50 gà (lúc 7 ngày tuổi). Mỗi con lấy 1ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng ựể xét nghiệm bằng phản ứng HỊ Nếu kết quả ựạt yêu cầu thắ nghiệm sẽ tiến hành nhỏ vacxin.
* Phương pháp kiểm tra an toàn
Sử dụng 50 gà 7 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa sử dụng vacxin Newcastlẹ Mỗi con ựược sử dụng 10 liều vacxin theo ựường nhỏ mắt, nhỏ mũị Gà ựối chứng không sử dụng vacxin ựược nhốt riêng. Quan sát gà trong 28 ngàỵ Quan sát theo dõi các chỉ tiêu về tỷ lệ chết, kiểm tra phản ứng bất lợi, triệu chứng lâm sàng và phản ứng cục bộ tại vị trắ tiêm và thể trọng của gà trong suốt quá trình khảo nghiệm.
Tắnh an toàn của vacxin là ựạt yêu cầu khi không có các triệu chứng lâm sàng và phản ứng bất lợi do vacxin ảnh hưởng ựến tỷ lệ sống và sự phát triển bình thường của gà.
* Phương pháp kiểm tra hiệu lực
Sử dụng 350 gà 7 ngày tuổi, khỏe mạnh, không có kháng thể phòng bệnh Newcastlẹ Mỗi gà ựược sử dụng 1 liều vacxin theo ựường nhỏ mắt, nhỏ mũị 100 gà ựối chứng không sử dụng vacxin ựược ựánh dấu và nhốt riêng. đàn gà ựược theo dõi 28 ngày, mỗi ngày quan sát 2 lần.
để ựánh giá hiệu lực của vacxin sử dụng 2 phương pháp sau:
+ Phương pháp huyết thanh học (bằng phản ứng HI): Tại thời ựiểm
14, 21 và 28 ngày sau khi sử dụng vacxin, lấy máu ngẫu nhiên 100 gà ở lô miễn dịch và 50 gà ở lô ựối chứng. Mỗi con lấy 1ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh và làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI).
Phương pháp tiến hành phản ứng HA, HI ựược mô tả chi tiết trong giáo trình Vi vật thú y của trường đại học Nông nghiệp I Ờ Hà Nội (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
+ Phương pháp công cường ựộc: tại thời ựiểm 14 ngày sau miễn dịch,
bắt ngẫu nhiên 20 gà miễn dịch và 10 gà ựối chứng, mỗi con ựược thử thách với chủng virus Newcastle cường ựộc VN91 với liều 106ELD50/con. Theo dõi 10 ngàỵ Phương pháp công cường ựộc theo tiêu chuẩn 10 TCN 181 Ờ 93 và khuyến cáo của OIE 2008.
Yêu cầu: Gà miễn dịch sống khỏe ≥ 80%
Gà ựối chứng chết ≥ 80% vì bệnh Newcastle
2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu
Chúng tôi xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tắnh bằng phần mềm Excel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC đỊNH MỘT SỐ đẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS NEWCASTLE CƯỜNG đỘC CHỦNG VN91 VIRUS NEWCASTLE CƯỜNG đỘC CHỦNG VN91
Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 ngoài nhiệm vụ kiểm nghiệm thuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm còn là nơi lưu giữ giống vi sinh vật thú y ựể phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn ựoán cũng như chế tạo vacxin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và ựược nhập từ nước ngoàị
Hiện nay Trung tâm ựã và ựang lưu trữ, bảo tồn 50 chủng giống vi sinh vật. Hầu hết các chủng giống ở Trung tâm ựều ựược bảo quản ở tủ - 500C ựến -80oC. Sau thời gian bảo quản 2 Ờ 3 năm các chủng giống vi sinh vật lại ựược bảo tồn bằng các phương pháp truyền thống: tăng cường trên phôi trứng hay trên bản ựộng vật mẫn cảm rồi ựông khô và lưu trữ. Trong quá trình giữ giống có rất nhiều yếu tố tác ựộng làm tắnh kháng nguyên, tắnh ựộc lực, ựặc tắnh sinh học của các chủng giống có thể thay ựổị để kiểm tra, ựánh giá chất lượng của chủng virus Newcastle cường ựộc VN91 sau nhiều năm bảo quản. Trước khi tiến hành kiểm tra ựặc tắnh sinh học của giống virus, chúng tôi tiến hành kiểm tra ựộ vô trùng và thuần khiết của giống.
*Kết quả kiểm tra vô trùng của giống
Mỗi giống virus phải ựược thiết lập một bộ hồ sơ giống và xác ựịnh rõ tên chủng, nguồn gốc và không ựược tạp nhiễm bất cứ loại vi khuẩn, nấm mốc và các virus ngoại lai khác. Các giống gốc phải ựược bảo quản một cách cẩn thận, không ựược làm nhiễm chéo giữa các chủng virus với nhau hoặc giữa các chủng nhược ựộc với các chủng cường ựộc. Vì lý do trên, giống virus chúng tôi nghiên cứu phải ựược kiểm tra vô trùng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 Giống virus bảo quản dưới dạng ựông khô ựược pha trở lại bằng nước muối sinh lý hoặc PBS vô trùng.
Cấy huyễn dịch virus giống (lượng cấy kiểm tra bằng 1 Ờ 2% dung tắch môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt và nước thịt gan yếm khắ, mỗi loại 2 ống. Môi trường ựã cấy kiểm tra ựược theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm ựể ở nhiệt ựộ phòng (25 Ờ 300C). Kết quả kiểm tra vô trùng ựược thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng của giống
Thạch máu Thạch nấm Thạch thường Nước thịt Yếm khắ MT Ngày 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - - 6 - - - - 7 - - - - Kết quả đạt đạt đạt đạt đạt
Ghi chú : (-) âm tắnh (không có vi khuẩn hoặc nấm mọc)
Qua bảng 3.1 cho thấy, sau 7 ngày theo dõi toàn bộ các môi trường ựều không có bất kỳ loại vi khuẩn, nấm nào mọc. điều này chứng tỏ giống virus không bị tạp ựảm bảo vô trùng.
Căn cứ theo tiêu chuẩn ngành 161-92, (Cục Thú y, 1994), giống virus Newcastle cường ựộc VN91 ựạt tiêu chuẩn vô trùng. Kết quả này cũng ựáp ứng ựược yêu cầu của OIE, (2008) và tiêu chuẩn ASEAN, (2002).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 Từ kết quả kiểm tra vô trùng cho thấy, giống virus Newcastle cường ựộc VN91 ở Trung tâm sau nhiều năm lưu trữ giống vẫn ựảm bảo ựộ vô trùng. điều ựó chứng tỏ giống virus ựược bảo quản rất cẩn thẩn và ựảm bảo tuyệt ựốị
*Kết quả kiểm tra ựộ thuần khiết của giống
Dùng 2 ống giống ựông khô, mỗi ống ựược hoàn nguyên 0,1ml dung dịch PBS PH 7,2 vô trùng, trộn lẫn 2 ống giống với nhaụ Thêm vào huyễn dịch trên 1,8ml dung dịch PBS PH 7,2 vô trùng ta ựược giống có ựộ pha loãng 10-1.
- Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Lấy giống ựã pha loãng cấy vào môi trường canh thang PPLO và trên ựĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh Ngựa và chất chiết nấm men, cấy 0,1ml trên 1 ựĩa thạch. để ở nhiệt ựộ 37oC theo dõi 14 ngàỵ Tại các thời ựiểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 ựĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 ở 37oC có 5% khắ CO2. Kết quả sau 18 ngày theo dõi giống kiểm tra không thấy có tạp nhiễm Mycoplasmạ
- Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Salmonella