IV. BÀN LUẬN
4.1.2.Kiểm tra chuyển nạp
Phản ứng chuyển nạp cho phép lựa chọn các tế bào cảm biến chứa
plasmid tái tổ hợp để sau đó có thể nhân dòng. Có thể chuyển nạp bằng phương pháp sốc điện hoặc sốc nhiệt tế bào, nhưng nhiều phòng thí nghiệm y
học thường dùng phương pháp sốc nhiệt tế bào. Với những phương tiện có
sẵn, đề tài nghiên cứu này cũng áp dụng quy trình sốc nhiệt cho cả 2 loại vec-
tơ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng tế bào cảm biến là E.coli
chủng lacZΔDH5α, lựa chọn chuyển nạp bằng cơ chế bù α của gen β- galactosidase (Hình 4.2).
Enzyme β-galactosidase là một protein được mã hóa bởi nhóm gen lac
(operon) và tồn tại ở dạng cấu trúc bậc 4 đồng nhất (homotetramer) có hoạt
tính. Tuy nhiên, đột biến β-galactosidase của chủng E.coli M15 làm tổng hợp
peptide ω và ở dạng bất hoạt do tetramer không được hình thành. Dạng hoạt
tính tetramer sẽ được hồi phục khi có mặt peptide α. Sự hồi phục chức năng
là tế bào cảm biến mang gen đột biến lacZ (lacZΔM15) nên tổng hợp peptide ω còn plasmid có trình tự lacZα nên tổng hợp được peptide α. Cả 2 dạng
peptide ω và α đều không có hoạt tính chức năng nhưng khi chúng cùng có
mặt thì tạo ra được một enzyme β-galactosidase có hoạt tính chức năng giống như khi trình tự lacZα được chuyển nạp vào tế bào cảm biến mà không có
lacZΔM15. Enzyme β-galactosidase có cơ chất là X-gal - một đồng phân
không mầu của lactose - enzyme này thủy phân X-gal để tạo thành 5-bromo- 4-chloro-indoxyl, chất này ngay lập tức tạo thành cấu trúc bậc 2 (dimer hóa) và được oxy hóa để tạo thành một sắc tố không hòa tan có mầu xanh nhạt là 5,5-dibromo-4,4dichloro-indigo. Như vậy, những tế bào có chứa enzyme β- galactosidase có hoạt tính sẽ có mầu xanh đậm, hay nói cách khác, khuẩn lạc
mầu xanh đậm có nghĩa là tế bào cảm biến chứa véc-tơ mang lacZα không bị
phá hủy (không có hiện tượng chèn trình tự đích vào hay chuyển nạp không thành công). Phương pháp sàng lọc bằng chọn khuẩn lạc mầu trắng/xanh dựa
vào việc phá hủy quá trình bù α. Khi ADN được chèn vào véc-tơ giữa gen
lacZα thì gen này bị phá hủy và do vậy không tổng hợp được peptide α nên không tạo thành được enzyme β-galactosidase có hoạt tính dẫn đến X-gal không bị thủy phân để chuyển thành dạng sắc tố mầu xanh, hay nói cách
khác, khuẩn lạc mầu trắng là những khuẩn lạc không tạo được enzyme β- galactosidase có hoạt tính do plasmid chứa trình tự đích đã chèn vào lacZα
(chuyển nạp thành công). Hình 3.2 cho thấy trong số hàng trăm khuẩn lạc
E.coli mọc trên các đĩa thạch LB đường kính 9cm, không có hoặc chỉ có vài khuẩn lạc mầu xanh đậm, còn lại toàn bộ đều có mầu trắng hoặc xanh nhạt. Điều này cho thấy phản ứng chuyển nạp của đề tài này đã thành công [136].
Hình 4.2. Cơ chế bù α lựa chọn các tế bào cảm biến. Véc-tơ TOPO pCR2.1.
Mặc dù có thể lựa chọn chuyển nạp bằng cách dựa vào màu sắc khuẩn
lạc nhưng kháng sinh ampicillin với nồng độ cao 50-100μg/ml được thêm vào
môi trường để đảm bảo những vi khuẩn tạp nhiễm không thể mọc được còn những vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp vẫn có thể phát triển bình thường do
véc-tơ có chứa các gen đề kháng kháng sinh này [132],[133].
Sau khi đã có những khuẩn lạc trắng hoặc xanh nhạt (chuyển nạp thành công), sản phẩm chuyển nạpđược kiểm tra bằng khuếch đại sử dụng mồi đặc
hiệu và mồi của véc-tơ (cặp mồi T7/M13R) để khẳng định về mặt kích thước
sản phẩm ADN đích đã chèn được vào véc-tơ. Nếu chỉ sử dụng cặp mồi đặc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hiệu mà không phải mồi của véc-tơ thì vẫn có thể có trường hợp dương tính
giả do ADN khuôn mẫu của phản ứng chuyển nạp vẫn tồn tại trong môi
P Laci P O Lac
Β-galactosidase bất hoạt
X-gal Sản phẩm mầu xanh
lacZ
LacZ
Β-galactưosidase hoạt
trường và được khuếch đại chứ chưa thực sự được chèn vào vec-tơ. [132],[133].
Hình 4.3. Bản đồ genome của véc-tơ pGEM T-Easy.
Nguồn: www.promega.com[133].
Hình 3.3. là kết quả khuếch đại đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A, trọng lượng đích khi khuếch đại với mồi đặc hiệu A1/A2 là 212bp (giếng 3-9) còn trọng lượng đích khi khuếch đại với mồi vec-tơ T7/M13R là
khoảng 410bp (giếng 11-17). Về lý thuyết, PCR là một quá trình nhắc lại của
3 phản ứng liên tục: biến tính ADN sợi kép thành ADN sợi đơn; gắn mồi đặc
hiệu vào chuỗi ADN sợi đơn tại đầu 5’-3’; và kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính
enzyme từ đầu 3’ theo hướng 3’-5’ để tổng hợp chuỗi ADN bổ trợ mới. Chiều
dài của sản phẩm là tổng chiều dài của 2 đoạn mồi và chiều dài khoảng cách
giữa 2 đoạn mồi của khuôn mẫu [2],[47]. Dựa vào cấu trúc của bản đồ
genome của vec-tơ pGEM T Easy ta có chiều dài mồi T7 và M13R tương ứng
là 20bp và 17bp, trình tự chức năng giữa 2 mồi là 163bp, và sản phẩm đích là 212bp. Tổng kích thước sản phẩm đích khi khuếch đại với cặp mồi T7/M13R
phải là 212bp + 37bp + 163bp = 412bp. Như vậy, xét về mặt kích thước, sản
phẩm đích đã cài được vào vec-tơ [133].
Trên thực tế, vẫn có những trường hợp sản phẩm khuếch đại có kích
thước như mong muốn nhưng đó lại là sản phẩm không đặc hiệu, một điều rất
hay xảy ra ở những người mới làm thử nghiệm tạo dòng và chuyển nạp. Giải
trình tự gen với cặp mồi của véc-tơ, ví dụ T7 và M13 R, và tốt nhất là giải
trình tự 2 chiềuđể khẳng định chuyển nạp ở mức nucleotide. Hình 3.4.b cho thấy, sau trình tự T7 “TAATACGACTCACTATAGGG” là các trình tự chức
năng khác của vec-tơ
“GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGC
GGGATT” và trình tự này được nối liền với trình tự của đoạn gen 4 mã hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
protein HA của virus cúm A/H5N1 (“CGATT...”), điều này có thể khẳng định ở mức độ nucleotide rằng trình tự đích đoạn gen 4 mã hóa protein HA của virus cúm A/H5N1 đã được cài vào vec-tơ [132],[133],[137],[138].
Sau khi có kết quả giải trình tự gen, so sánh với trình tự của NCBI tại
http://www.ncbi.com để xác định chính xác vị trí của đoạn gen đích, tên chủng, các chủng gần nhất, tỷ lệ đồng nhất và vị trí khác biệt ở mức
chứa nhiều thông tin di truyền của virus nhất. Hình 3.5 và Hình 3.6 cho thấy
chủng virus cúm mùa sử dụng trong đề tài nghiên cứu này được khẳng định
bằng Blast và gần với chủng virus cúm mùa H3N2 A/Rotterdam/577/1980 với
số đăng nhập là CY112354 và vị trí khuếch đại là 101-312, đúng với thông tin
về vị trí và trình tự mồi mà tác giả Donofrio và cộng sự thiết kế cặp mồi đặc
hiệu A1/A2 đã công bố. Bảng 3.1 là tổng hợp các thông tin về chiều dài và
gen đích của các tác nhân nghiên cứu trong đề tài này. Khu vực khuếch đại đều là những vùng ổn định nhất nên hoàn toàn phù hợp cho chẩn đoán [139].