IV. BÀN LUẬN
4.1.1.Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp
Trước tiên, để thực hiện phản ứng tạo dòng thì cần một sản phẩm PCR
[132-134]. ARN/ADN tách chiết từ chủng virus, chủng vắc xin hoặc từ bệnh
phẩm xác định được sử dụng làm khuôn mẫu cho RT-PCR/PCR [28-30]. Sản
phẩm được kiểm tra bằng chạy điện di trên thạch agarose có nồng độ phù hợp
với trọng lượng đích của sản phẩm và có mặt thuốc nhuộm dải ADN (SYBR) [135]. Kích thước của sản phẩm được kiểm tra và khẳng định dựa vào thang ADN chuẩn phù hợp. Hình 3.1 là kết quả phản ứng khuếch đại 7 đoạn gen
mã hóa protein M, HA, và NA virus cúm mùa và A/H5N1. Mỗi sản phẩm chỉ
có một dải ADN duy nhất, nhìn rõ ràng và sắc nét, có kích thước phù hợp với
vị trí khuếch đại (Bảng 3.1). Đây là một trong số các yếu tố đảm bảo sản
phẩm chuyển nạp không bị tạp nhiễm bởi các sản phẩm không đặc hiệu.
Với cúm, mặc dù khu vực khuếch đại đều là những đoạn gen ổn định
nhất nhưng ARN nguồn sử dụng để sản xuất chứng dương đều được tách
chiết từ chủng virus (cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh ở người) hoặc mẫu bệnh
phẩm (A/H3N2, A/H1N1pdm09) được thu thập từ những bệnh nhân Việt
Nam để đảm bảo không có sự khác biệt quá lớn về di truyền vì sản phẩm
ARN được sử dụng trong chẩn đoán tại khu vực nghiên cứu của Việt Nam.
Tạo dòng là một kỹ thuật đơn giản, chỉ mất 5 phút thực hiện, tùy
thường quy mà có một bước (TOPO®pCR2.1 - Invitrogen) hoặc hai bước thực
hiện (pGEM-T Easy - Promega) để cài trực tiếp một đoạn ADN vào một véc-
(Invitrogen) ở dạng mạch thẳng với đầu 3’ gắn sẵn Thymine (T) và topoisomerase bằng phương pháp đồng hóa trị (véc-tơ hoạt hóa). Do Taq
polymerase có hoạt tính vận chuyển (transferase) đầu tận cùng không phụ
thuộc khuôn mẫu nên nó sẽ thêm một deoxyadenosine (A) vào đầu 3´ của sản
phẩm PCR. Véc-tơ mạch thẳng của bộ sinh phẩm có một đầu treo 1
deoxythymidine. Điều này cho phép sản phẩm PCR chèn và nối được với
véc-tơ một cách hiệu quả (cầu nối A-T) (Hình 4.1) [132],[134].
Hình 4.1. Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo dòng (clonning).
Nguồn:www.Invitrogen.com [132].
Theo Shuman và cộng sự, topoisomerase I của virus đậu gắn vào ADN kép ở một vị trí đặc hiệu và cắt các khung phosphodiester sau 5′-CCCTT của
một chuỗi. Năng lượng từ khung phosphodiester sau khi bị cắt được bảo toàn bằng cách hình thành một cầu nối đồng hóa trị giữa 3′ phosphate của chuỗi bị
cắt và một tyrosyl (Tyr-274) của topoisomerase I. Cầu nối phospho-tyrosyl giữa ADN và enzyme sau đó bị tấn công bởi 5′ của chuỗi bị cắt ban đầu, làm
đảo chiều phản ứng và giải phóng topoisomerase. TOPO® Cloning khai thác phản ứng này để tạo dòng sản phẩm PCR một cách có hiệu quả (Hình 4.1). Với trường hợp sử dụng vec-tơ pGEM T Easy, do không có sẵn
topoisomerase nên cần thực hiện thêm bước gắn sản phẩm vào véc-tơ nhờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
enzyme T4 ligase (Bảng 2.2.b), các bước tiếp theo thực hiện tương tự như với
véc-tơ TOPO [132],[133].