CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2 Các phương pháp ựánh giá chất lương sinh khối của tảo
2.3.2.1 Q trình ni tảo Spirulina platensis bằng khắ thải ựốt than
Hình 2.4. Sơ ựồ dây chuyền ni tảo bằng khắ thải ựốt than
Thuyết minh dây chuyền
Quá trình sản xuất tảo có ba bước chắnh là chuẩn bị nguyên liệu, nuôi cấy và thu hoạch. Nguyên liệu ban ựầu ựể sản xuất tảo bao gồm: giống, ánh
sáng, nguồn nước, dinh dưỡng, và khắ CO2.
Nguồn nước sau khi ựã ựược xử lý ựể loại bỏ các tạp chất, các vi sinh vật gây bệnh, và bổ sung nguồn dinh dưỡng thắch hợp sẽ ựược ựưa vào bể nuôi. Tại ựây tảo nguyên liệu ựã nuôi cấy ban ựầu cũng ựược ựưa vào và bắt ựầu quá trình ni cấy. Trong suốt q trình này nguồn dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy phải ựược bổ sung liên tục theo chu kỳ 12h một lần ựể tránh hiện tượng sốc pH và hiện tượng thay ựổi áp suất thẩm thấu ựột ngột. đồng thời trên bể nuôi cũng ựược bố trắ các cánh khuấy và môtơ vận hành các cánh khuấy ựể thường xuyên cung cấp CO2 cho tảo quang hợp.
Tảo khi ựã ựạt ựược yêu cầu mật ựộ sẽ ựược tiến hành thu hoạch và ựưa vào máy lọc và ép ựể tách nước, khi lọc nước sẽ ựược tách ra và ựưa trở lại bể nuôi cấy. Từ ựó sản phẩm qua giai ựoạn chế biến ựể làm thực phẩm, dược phẩm hay là trong sản xuất mỹ phẩm.
Các ựiều kiện nuôi cấy Bể nuôi
Bể thông thường ựược xây dựng bằng vật liệu xây dựng như gạch, xi măng,Ầcó ựộ sâu khoảng 70 cm ựến 100 cm. Khi nuôi mực nước trong bể khoảng 30 cm ựến 50 cm. Việc xây dựng bể và ựặt cánh khuấy phải ựảm bảo sao cho nước lưu thông tốt tránh bị lắng ựọng ựồng thời thu nhận ựược ánh sáng nhiều nhất.
Cánh khuấy
Cánh khuấy nhằm mục ựắch tạo sự tiếp xúc tốt hơn cho sinh khối tảo với dinh dưỡng, ánh sáng và khắ cacbonic. Ngồi ra nó cịn giữ ổn ựịnh nhiệt ựộ trong bể nuôi giúp tảo phát triển tốt hơn.
Tiến hành nuôi và quản lý hệ thống
Nước sau khi ựã xử lý sơ bộ, ựược bơm vào bể nuôi cấy, nước phải ựảm bảo pH theo yêu cầu từ 8,5 Ờ 10,5 bằng cách bổ sung NaHCO3 và sục khắ CO2. Tiến hành gieo cấy giống với mật ựộ tế bào 0,8 g/ L bằng cách bơm vào bể. Sau khi gieo cấy giống, tiến hành khuấy trộn thường xuyên.
Ánh sáng mặt trời ựảm bảo ựộ chiếu sáng cần thiết 25 - 40 klux. Tiến hành ựo nhiệt ựộ và pH mỗi ngày ắt nhất hai lần, ựảm bảo nhiệt ựộ nước từ 25oC - 40oC. Sau thời gian nuôi cấy, kiểm tra mật ựộ tế bào ựạt theo ựúng năng suất yêu cầu thì tiến hành thu hoạch.
Thường xuyên kiểm tra các yếu tố sinh học gây ảnh hưởng xấu trong quá trình ni cấy như: ựộng vật chân chèo, virus, vi khuẩn, các loại tảo tạp khác...và tùy theo ựặc ựiểm của từng lồi mà ta có biện pháp tiêu diệt khơng cho chúng phát triển [16, 17].
2.3.2.2 Tốc ựộ sinh trưởng ựược xác ựịnh bằng giá trị OD trên máy quang phổ, trọng lượng khô của tảo
định tắnh nồng ựộ sinh khối trong môi trường, dựa vào ựộ hấp thụ quang của các sắc tố Chlorophyll trong tế bào. Các sắc tố này hấp thụ chủ yếu 2 bước sóng trong ánh sáng mặt trời tương ứng là 420 nm và 665 nm [2]. đối với tảo Spirulina platensis, tiến hành ựo mật ựộ tảo bằng máy quang phổ UV- 2450 Shimatzu (Nhật Bản) ở bước sóng 445nm và ựánh giá qua trọng lượng khô (TLK) theo ựồ thị chuẩn phản ánh mối tương quan giữa OD và TLK.
2.3.2.3 Hiệu quả hấp thụ khắ CO2 từ khắ thải ựốt than của tảo Spirulina platensis SP4
phản ứng quang sinh ở mỗi thời ựiểm pH ựang thay ựổi
2.3.2.4 Xác ựịnh pH môi trường nuôi tảo
độ pH của môi trường ni tảo ựược kiểm sốt liên tục theo thời gian bằng máy pH Control (Hãng Hanna)
2.3.2.5 Xác ựịnh kiềm tổng (HCO3- và CO32-) bằng phương pháp chuẩn ựộ axit 0,1N HCl
độ kiềm trong nước gây ra do sự có mặt của các anion axit yếu mà chủ yếu là các ion OH-, CO32-, HCO3-. Khi pH của nước lớn hơn 8,2 thì ựộ kiềm của nước do cả ba loại ion trên gây ra. Khi pH của nước nhỏ hơn 8,2 thì khơng tồn tại hai loại ion OH- và CO32-, ựộ kiềm do ion HCO3- gây ra.
+ Hóa chất sử dụng:
Ớ HCl
Ớ Metyl da cam
Ớ Phenolphtalein + Pha chế:
Ớ Dung dịch HCl 0.1 N: pha HCl trong ống chuẩn 0,1 N thành 1 L với nước cất.
Ớ Dung dịch chỉ thị Phenolphtalein: hòa tan 0,1 g Phenolphtalein vào 100 ml cồn.
Ớ Dung dịch chỉ thị metyl da cam: hòa 0,1 g metyl da cam vào 100 ml nước cất.
+ Cách làm:
- Xác ựịnh CO32- : Lấy 10 ml mẫu, thêm 1 giọt phenolphtalein, nếu xuất hiện màu hồng thì có kiềm tự do. Chuẩn ựộ với HCl 0,1 N tới khi hết màu. Ghi nhận thể tắch HCl ựã chuẩn (V1).
X1 (g/L) = V1*N*60*1000 V
- Xác ựịnh HCO3-: Lấy 10 ml mẫu, thêm 1 giọt metyl da cam. Chuẩn ựộ với HCl 0,1 N tới khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu gạch non. Ghi nhận thể tắch HCl ựã chuẩn (V2).
X2 (g/L) = (V1-V2)*N*61*1000 V
- Với X1, X2 lần lượt là nồng ựộ của CO32- và HCO3-
- V1 là thể tắch của HCl 0,1 N chuẩn ựộ với Phenolphtalein (ml) - V2 là thể tắch của HCl 0,1 N chuẩn ựộ với Metyl da cam (ml) - V là thể tắch mẫu lấy ựể chuẩn (ml)
- N là nồng ựộ HCl pha ựể chuẩn - 60 là ựương lượng gam của CO32- - 61 là ựương lượng gam của HCO3- - 1000 ựể quy ựổi về 1 L.
2.3.2.6 .Xác ựịnh prôtêin, carotenoid, tro, hàm lượng hydratcacbon, lipit tổng
Phương pháp phân tắch hàm lương hàm lượng các mẫu tảo ựược thu tại pha cân bằng khi tảo ựạt sinh khối ở ngày nuôi thứ tám tới thứ mười các tảo ựược tách ly tâm khỏi môi trường bằng máy ly tâm có ựộ quay 7000 vòng/ phút trong thời gian 10 phút sử dụng máy Hereaus Suprafuge, mẫu tảo sau ựó ựược sấy khơ ở nhiệt ựộ 550C trong 2 giờ lưu giữ nhiệt ựộ ở âm 200C trước khi thực hiện phân tắch hóa sinh hàm lương lipit ựược phân tắch phương pháp của Bligh và Dyer (1959) sử dụng hỗn hợp tách chiết chứa chloroform và methanol với tỷ lệ thể tắch là 2 : 1. Khoảng 120 ml của hỗn hợp này ựược sử dụng ựể tách chiết mỗi gam tảo khô.Các cất rắn ựược phân tách một cách cẩn thận bằng cách sử dụng giấy lọc chuyên dụng 2 lớp của Nhật Bản. Các chất hịa tan và dung mơi ựược làm bay hơi trong máy hút chân không ở nhiệt ựộ 60ồC. Quá trình tách chiết ựược thực hiện 3 lần cho ựến khi thu ựược toàn bộ
lượng lipid thô trong mẫu tảo. Protein thô ựược phân tắch bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 1998).
Xác ựịnh carotenoid, tro ựược xác ựịnh theo phương pháp của Timothy R. Parsons (1992);
Hàm lượng Hydratcacbon theo phương pháp Bertrand, lipit tổng số xác ựịnh theo phương pháp khối lượng Weibull-Berntrop.
Quá trình phân tắch thành phần protein, carotenoid, tro, hàm lượng hydratcacbon, lipit tổng ựược tiến hành tại Viện Hóa Học các hợp chất thiên nhiện, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam.
2.3.2.7 Các phương pháp ựánh giá kim loại nặng, ựộc tắnh cấp
Phương pháp phân tắch các kim loại nặng theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), mẫu phân tắch gửi tại Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam.
Phương pháp xác ựịnh ựộc tắnh cấp của thuốc Ờ Nhà xuất bản Y học 1996.
OECD guidelines for testing of chemicals. Acute oral toxicity Ờ Up
and Down procedure OECD 425, 2001. (Phương pháp ựánh giá kim loại nặng thực hiện ở Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương- Bộ Y tế)
động vật thắ nghiệm:
- Loài: chuột nhắt trắng giống Swiss. - Cân nặng: 18-22g.
- Số lượng: 50 con
- Nguồn gốc cung cấp: Viện vệ sinh dịch tễ trung ương.
- điều kiện chăm sóc: đVTN ựược ni trong ựiều kiện chuồng thống mát, ựảm bảo vệ sinh, chế ựộ ăn uống theo nhu cầu của chuột.
- Cân nặng: Tất cả đVTN ựược ựể ổn ựịnh 3 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá trình thử nghiệm.
Mẫu thử:
Thử sơ bộ:
- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Cân một lượng mẫu thử, nghiền kỹ, trộn ựều với nước làm thành hỗn dịch thử có chứa 0,65g mẫu thử/ ml nước.
- Thăm dị ở mức liều khơng làm chết chuột thắ nghiệm:
Dùng 10 chuột, cho mỗi chuột uống 0,4 ml mẫu thử x 3 lần (mỗi lần cách nhau 2 giờ) tương ựương mức liều 39,0g mẫu thử/kg chuột (mức liều tối ựa có thể cho uống). Sau 24 giờ theo dõi, khơng có chuột thắ nghiệm bị chết.
Thử nghiệm chắnh thức:
- Các mức liều thử nghiệm:
Mức liều 1: 13,0g mẫu thử/ kg chuột x 1 lần uống
Mức liều 2: 13,0g mẫu thử / kg chuột x 2 lần uống (mỗi lần uống cách nhau 2 giờ).
Mức liều 3: 13,0g mẫu thử / kg chuột x 3 lần uống (mỗi lần uống cách nhau 2 giờ).
- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Cân một lượng mẫu thử, nghiền kỹ, trộn ựều với nước làm thành hỗn dịch thử có chứa 0,65g mẫu thử/ ml nước.
- Mẫu chứng: Nước (uống)
Tiến hành:
- Chuột ựược nhịn ăn 15 - 18 giờ trước khi thắ nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột ựạt yêu cầu về cân nặng ựược ựưa vào thử nghiệm.
- Cách dùng: đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo ựường uống. Lấy thể tắch mẫu thử theo quy ựịnh ựưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong ựầu tù.
- Tiến hành thử nghiệm chắnh thức trên 40 chuột, chia thành 4 nhóm gồm 1 nhóm chứng dùng nước cất và 3 nhóm thử theo mức liều ựã dự tắnh. Các nhóm thử ựược dùng các hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần ựưa mẫu
thử như sau: Bảng 2.1: Bố trắ thắ nghiệm thử ựộc tắnh cấp Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch thử/20g chuột) Liều dùng (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột thắ nghiệm Nhóm chứng 0,4 ml dd nước cất x 3 lần ---- 10 Mức liều 1 0,4ml hỗn dịch thử x 1 lần 13,0g/kg chuột 10 Mức liều 2 0,4ml hỗn dịch thử x 2 lần 26,0g/kg chuột 10 Mức liều 3 0,4ml hỗn dịch thử x 3 lần 39,0g/kg chuột 10
- Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong vòng 2 giờ, 24 giờ ựầu và theo dõi hoạt ựộng của đVTN trong thời gian 7 ngày sau khi uống.