2.2.3.1 Phương pháp ựiều tra bệnh
Ớ Theo phương pháp ựiều tra của Viện bảo vệ thực vật, tập I, Tập II, Tập III và Tài liệu dịch học.
Ớ địa ựiểm: Huyện Phù Ninh, đoan Hùng, Lâm Thao, Hạ HòaẦ.tỉnh Phú Thọ đất bãi vụ hè năm 2012 ở các huyện Huyện Phù Ninh, đoan Hùng, Lâm Thao, Hạ Hòa (3 Ờ 5 ựiểm/huyện)
Ớ Phương pháp ựiều tra; theo ỘPhương pháp nghiên cứu BVTV, tập II, Viện BVTV-1999): ựiều tra theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 10 cây ngô ngẫu nhiên trong 10 câỵ
Ớ Chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ bệnh
+ Chỉ Số bệnh + Mức ựộ phổ biến
Tổng số cây hoặc bộ phận của cây (lá,thân, bắpẦ ) bị
bệnh Tỷ lệ bệnh/tỷ lệ hại (%) =
Tổng số cây hoặc bộ phận của cây (lá, thân, bắpẦ) ựiều
tra x 100 Chỉ số bệnh/chỉ số hại (%) = x 100 Trong ựó: N1 là (lá, thân, bắp Ầ) bị bệnh ở cấp 1; N3 là (lá, thân, bắp Ầ) bị bệnh ở cấp 3; Ầ [ ] Nxn Nnxn x N x N x N1 1) ( 3 3) ( 5 5) ..( ) ( + + +
Nn là (lá, thân, bắp Ầ) bị bệnh ở cấp n. N là tổng số (lá, thân, bắp Ầ) ựiều trạ n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9).
2.2.3.2 Phương pháp thu thập mẫu
Với những mẫu nấm gây bệnh trên lá: gỉ sắt Puccinia maydis, ựốm lá lớn Ẹturcicum, ựốm lá nhỏ Bipolaris maydisẦ cho mẫu lá bị bệnh vào hộp mẫu, lưu trữ trong tủ mát và phân lập trong vòng 48h.
2.2.3.3 Phương pháp kiểm tra nấm từ vết bệnh
a . Kiểm tra trực tiếp vết bệnh (thắch hợp cho các mô mỏng như lá cây)
Ớ Chuẩn bị một lam sạch
Ớ Cắt vết bệnh cần quan sát thành các mảnh nhỏ kắch thước khoảng 1-2 cm. Mẫu bệnh có thể ựược quan sát ngay sau khi thu thập ngoài ựồng hoặc ựể ẩm trong hộp petri từ hôm trước.
Ớ đặt tiêu bản lên lam sao cho phần vết bệnh hướng lên trên.
Ớ điều chỉnh kắnh ựể có ánh sáng tối ựa và quan sát ở ựộ phóng ựại thấp (vật kắnh: x4, x10).
Chú ý: Không nên cắt quá nhỏ mẫu bệnh và cần quan sát nhanh vì dưới cường ựộ ánh sáng mạnh, mẫu sẽ nhanh bị khô
b. Kiểm tra nấm bệnh bằng cố ựịnh lam
Chuẩn bị: lam, la men, que khêu nấm, dao mổ, nước cất vô trùng, mẫu bệnh. Mẫu bệnh (mẫu lá, quả, thân, cành, rễ, hạt) có thể ựược sử dụng ngay sau khi thu thập hoặc ựể ẩm.
Ớ Nhỏ một giọt nước cất lên lam
Ớ Dùng que khêu nấm hoặc dao mổ lướt nhẹ ựầu nhọn trên vết bệnh, nhúng vào trong giọt nước trên lam và khuấy nhẹ. Nhẹ nhàng ựậy la men lên
Ớ Quan sát ở ựộ phóng ựại từ thấp ựến cao (vật kắnh: x10→ x20→x40→x100).
Chú ý:
+ để quan sát quả thể, quả cành, ựĩa cành cần làm như sau: Ớ Dùng panh giữ chặt vết bệnh trên lam
Ớ Dùng dao mổ hoặc que khêu nấm có kim nhọn khều cẩn thận quả cành, quả thể và ựĩa cành khỏi mô bệnh và ựặt vào giọt nước trên lam. Thao tác sẽ dễ dàng hơn nhiều nếu ựược thực hiện dưới kắnh lúp ựiện.
Ớ đậy nhẹ nhàng la men lên trên giọt nước
Ớ Quan sát ở ựộ phóng ựại thấp (vật kắnh x10). Vừa quan sát vừa dùng panh hoặc que khêu nấm day nhẹ la men ở gần vị trắ có các cấu trúc trên sao cho chúng vỡ ra nhằm quan sát sự giải phóng bào tử từ quả cành, túi và bào tử túi từ quả thể.
+ để quan sát lát cắt của hạch nấm, thực hiện như sau: Ớ Dùng panh giữ chặt hạch nấm trên lam.
Ớ Dùng dao mổ mới hoặc dao cạo râu cắt hạch thành các lát càng mỏng càng tốt.
Ớ đặt lát cắt hạch vào giọt nước trên lam, ựậy la men và quan sát như trên.
c. Phát hiện nấm gây bệnh bằng kỹ thuật lam ép Mẫu bệnh:
Ớ Bệnh gỉ sắt (Puccinia sorghi Schw) Ớ Bệnh ựốm lá nhỏ: Bipolaris Maydis
Ớ Bệnh ựốm lá lớn Ẹ turcicum
* Trình tự
Cố ựịnh mẫu trong nước
2. đặt mẫu vào vị trắ giọt nước, dưới một kắnh lúp soi nổị
3. đặt lamen sao cho một cạnh chạm lam kắnh gần mép giọt nước. 4. Từ từ hạ cạnh bên kia của lamen xuống sao cho lamen trùm lên trên giọt nước phương pháp này giúp ựẩy các bọt khắ ra khỏi mẫu lam.
5. Dùng một miếng giấy thấm hoặc giấy lọc ựể thấm ựi phần nước thừa phắa ngoài lamen. Các bào tử từ cây bị bệnh hoặc mẫu nấm ựược nuôi cấy nhân tạo có thể ựược lấy ra dùng một que cấy và ựặt vào vị trắ giọt nước.
Các cấu trúc tạo bào tử lớn hơn cần ựược kiểm tra dưới kắnh lúp soi nổi, sau ựó ựược ựặt vào một giọt nước và làm dẹp bằng cách dùng một dụng cụ có bề mặt phẳng ép nhẹ lên lamen.
6. Kiểm tra mẫu lam dưới kắnh hiển vi ở các vật kắnh 10, 40, 100
2.2.3.4 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh Theo cẩm lang chẩn ựoán bệnh cây ở Việt Nam.
Chuẩn bị:
Ớ Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm
Ớ đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, ựĩa môi trường
Ớ Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl hoặc CăOCl)2 1-2%
Trình tự:
1.Chọn mẫu bệnh có triệu chứng ựiển hình, mới
2.Rửa mẫu bệnh sạch ựất cát bằng nước vòi (ựặc biệt là các mẫu rễ) 3.Cắt chọn mảnh mô bệnh thắch hợp
4.Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl hoặc CăOCl)2 1-2 %. Thời gian khử trùng từ 1-3 phút tùy vật liệu câỵ
5.Rửa lại bằng nước cất vô trùng
8.Dùng panh vô trùng ựặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WẠ 9.Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kắnh: Ngày, cây, bệnh...
10. để mẫu trong ựiều kiện nhiệt ựộ và ánh sáng thắch hợp.
11. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm ựã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần ựỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thắch hợp như PCA, PDA