Lá cây Khổ sâm mềm sau khi thu hái đƣợc thái nhỏ, phơi khô, nghiền thành bột (2,6 kg), ngâm chiết trong metanol (12 lít × 3 lần). Dịch chiết metanol sau đó đƣợc quay cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 191g dịch cô. Dịch cô này đƣợc hoà vào 1,5 lít hỗn hợp MeOH:nƣớc (1/1) rồi chiết phân bố lần lƣợt bằng các dung môi
n-hexan, diclorometan, etyl axetat. Sau khi cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cặn chiết n-hexan (80 g), diclometan (21 g), etyl axetat (8 g) và dịch nƣớc.. Hai cặn chiết n-hexan và diclometan cho các vết giống nhau trên sắc ký bảng mỏng TLC nên đƣợc gộp lại và tiến hành tách phân đoạn trên
Hình 2.1. Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm
cột silica gel pha thƣờng và hệ dung môi rửa giải lần lƣợt là n-hexan:axeton 100 - 40/1 - 20/1 - 10/1 - 5/1 - 2,5/1 - 1/1 - 0/100, thu đƣợc tám phân đoạn 1E (10 g), 1F (5 g), 1G (27 g), 1H (8 g), 1I (14 g), 1K (9 g), 1L (15 g), 1M (15 g). Phân đoạn 1G
25
(27 g) tiếp tục tách phân đoạn trên cột silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải diclometan:metanol (gradient, 1-100%), thu đƣợc 11 phân đoạn 12A (3 g), 12B (1,3 g), 12C (2,4 g), 12D (2,8 g), 12E (1 g), 12F (1,4 g), 12G (4,1g), 12H (700 mg), 12I (1 g), 12L (1,9 g), 12S (0,76 g).
Phân đoạn 12F (1,4 g) xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng axeton thu đƣợc chất sạch BM.01 (22 mg) (12N). Phân đoạn 12G (4,1 g) chạy tách chất lần lƣợt qua hai cột sắc ký trên silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải lần lƣợt là diclometan (100%) và n-hexan:axeton 20/1, thu đƣợc chất sạch BM.02 (24 mg) (MC218). Hai phân đoạn 12I và 12L xuất hiện chất kết tinh, tiến hành lọc rửa bằng metanol thu đƣợc chất sạch BM.03 (570 mg) (3R, 12K). Phân đoạn 12B đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải n-hexan:diclometan 2/1 thu đƣợc ba phân đoạn 14A (500 mg), 14B (180 mg), 14C (140 mg). Gộp hai phân đoạn (14B+14C) tiến hành sắc ký cột trên silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải n-hexan:etyl axetat 40/1, thu đƣợc hai chất sạch BM.04 (70 mg) (MC220) và
26
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm Cặn chiết n-hexan và CH2Cl2 của lá 101g 1E 1F 1G 1H 1I 1K 1M 1N 12C 12D 12E 12F 12G 12H 12I 12L 12S 12B 12A 14A 14B 14C D/M gradien ( 1- 100% MeOH) BM.01 22mg BM.03 570mg
Xuất hiện tinh
thể, lọc rửa bằng axeton
Xuất hiện tinh thể, lọc rửa bằng MeOH H/D 2/1 1.CCSiO2 CH2Cl22. CCSiO2 H/A20/1 BM.02 24 mg Kí hiệu:
H: n- hexan; A : axeton; E ; EtOAc; M : MeOH; N : nƣớc ; D : điclometan BM.04 70mg BM.05 75mg H/E 40/1
27
28