CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập
3.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm
Từ lá cây Khổ sâm mềm phân lập theo sơ đồ 2.1 và 2.2 thu đƣợc 4 hợp chất thuộc các lớp chất béo (BM.01, BM.02, BM.04, BM.05), 1 steroit (BM.03),
32
3.3.1.1 Hợp chất BM.01: octatriacontan-1-ol (12N) Hợp chất BM.01 thu được dưới dạng bột trắng.
Phổ 1H và 13C-NMR cho thấy phân tử có một nhóm metyl tại δ 13,7 ứng với proton tại δ 0,78, một nhóm metylen có liên kết với ôxy tại δ 62,3 ứng với proton tại δ 3,49 và 35 nhóm metylen nằm trong vùng δ 22,4 - 32,3 ứng với proton tại δ 1,16.
Điều này cho phép ta dự đoán hợp chất BM.01 là một ancol no, đơn chức và mạch thẳng.
Trong phổ ESI-MS của BM.01 xuất hiện peak ion giả phân tử tại m/z 550,6 [M+H]+, ứng với công thức phân tử C38H78O. Do vậy, hợp chất BM.01 đƣợc xác định là octatricontan-1-ol, hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ chi Brucea.
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01 3.3.1.2 Hợp chất BM.02: tetratriacontan-1-ol (MC218)
Hợp chất BM.02 thu được dưới dạng bột trắng.
Phổ 1H-NMR của BM.02 có các đặc điểm giống với phổ BM.01.
BM.02 có một nhóm metyl tại δ 0,88, hai nhóm metylen tại δ 1,57, 29 nhóm metylen tại δ 1,26 và một nhóm metylenhydroxy tại δ 3,64. Vì vậy dựa vào phổ 1H- NMR ta có thể dự đoán BM.02 cũng là một ancol no, đơn chức và mạch thẳng.
Trong phổ ESI-MS của BM.02 xuất hiện peak ion giả phân tử tại m/z 479,0 [M - H]- , ứng với CTPT C33H68O. Vậy BM.02 đƣợc xác định là tetratriacontan-1- ol và lần đầu tiên tách ra từ chi Brucea.
CTCT của BM.02 là :
33
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02 3.3.1.3 Hợp chất BM.03: stigmast-5,22-dien-3--ol (3R, 12K)
Hợp chất BM.03 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, không mùi, nhiệt độ nóng chảy 155-157oC, [α]D25 -450 (c = 0,05 trong CHCl3). Trong phổ
1H, 13C-NMR cho thấy có ba proton olefinic ở δ 5,34 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,12 (1H, dd), 5,03 (1H, dd) ứng với ba cacbon ở δ 121,7 (d, C-6), 138,4 (d, C-22), 129,3 (d, C-23).
Dựa vào đặc tính lý hóa và so sánh phổ với chất chuẩn, hợp chất BM.03 đƣợc xác định là stigmast-5,22-dien-3--ol, CTPT C29H58O.
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.03 3.3.1.4 Hợp chất BM.04: bombiprenone (MC220)
Hợp chất BM.04 thu được dưới dạng bột màu vàng, tan trong CHCl3, Rf = 0,25 (n-hexan: EtOAc 20/1). Phổ 1H, 13C-NMR và HSQC của BM.04 cho thấy trong phân tử có các nhóm chức có cùng độ chuyển dịch hóa học bao gồm: 7 nhóm metyl (nhóm V), 14 nhóm metylen (nhóm II + III), 7 nhóm metin (nhóm IV, cacbon lai hoá sp2) và 7 cacbon không có liên kết hydro (nhóm I). Trong phổ HMBC có các tương tác của H7/C5, H4/C6, H34/C5, C7, điều đó cho thấy trong phân tử tồn tại hợp phần dạng isopren. Vì có các nhóm chức giống nhau và kết hợp phân tích tương tác trong phổ HMBC cho ta biết trong phân tử BM.04 sẽ có 7 nhóm isopren tương đương hoá học và một nhóm isopren nữa ở cuối mạch phân tử. Tất cả 8 nhóm isopren này sẽ nối lại với nhau tạo thành mạch dài phân tử.
34
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.04
Vị trí
δCa
(ppm) δHb(ppm)
HMBC (HC)
COSY (HH)
NOESY (HH)
1 29,9 (q) 2,13 (3H, s) C2, C3 H3, H4, H3, H4
2 208,8 (s)
3 43,8 (t) 2,45 (2H, t, J = 7,5 Hz) C2, C4, C5 H1, H4, H1, H4 4 22,5 (t) 2,27 (2H, t, J = 7,5 Hz) C2, C3, C5,
C6 H1, H3, H5, H7, H34 H1, H3, H34
5 122,5 (d) 5,08 (1H) C4, C7, C34 H4, H34 H7
6
134,9- 136,5 (s) (I) 10
14 18 22 26 30 7
39,7 (t) (II)
1,97-2,00 (14H, t, J = 7,5 Hz)
C5, C6, C8,
C9, C34 H8, H34 H5, H8, H9, H34
11 C10, C12,
C13, C35 H12, H35 H9, H12, H13, H35
15 C14, C16,
C17, C36 H16, 36 H13, H16, H17, H36
19 C18, C20,
C21, C37 H20, H37 H17, H20, H21, H37
23 C22, C24,
C25, C38 H24, H38 H21, H24, H25, H38
27 C26, C28,
C29, C39 H28, H39 H25, H28, H29, H39
31 C30, C32,
C33, C40 H32, H40 H29, H32, H33, H40 8
26,6-26,8 (t) (III)
2,05-2,09 (14H, t, J = 7,5 Hz)
C6, C7, C9,
C10 H9, H7, H34, H35 H7, H9, H34, H35
12 C10, C11,
C13, C14 H13, H11, H35, H36 H11, H13, H35, H36
16 C14, C15, H17, H15, H36, H37 H15, H17, H36,
35
Vị trí
δCa
(ppm) δHb(ppm)
HMBC (HC)
COSY (HH)
NOESY (HH)
C17, C18 H37
20 C18, C19,
C21, C22 H21, H19, H37, H38 H19, H21, H37, H38
24 C22, C23,
C25, C26 H25, H23, H38, H39 H23, H25, H38, H39
28 C26, C27,
C29, C30 H29, H27, H39, H40 H27, H29, H39, H40
32 C30, C31,
C33, C41
H42, H33, H31, H40, H43
H31, H33, H40, H42, H43 9
124,1- 124,4 (d)
(IV)
5,10-5,13 (7H)
C7, C8, C35 H8, H35 H7, H8, H11
13 C11, C12, C36 H12, H36 H11, H12, H15
17 C15, C16, C37 H16, H37 H15, H16, H19
21 C19, C20, C38 H20, H38 H19, H20, H23
25 C23, C24, C39 H24, H39 H23, H24, H27
29 C27, C28, C40 H28, H40 H27, H28, H31
33 C31, C32,
C42, C43 H42, H32, H43 H31, H32, H42 34
16,0 (q)
(V) 1,57-1,60 (21H, s)
C5, C6, C7 H4, H5, H8,H7 H4, H7, H8
35 C9, C10, C11 H9, H8, H12, H11 H8, H11, H12
36 C13, C14, C15 H13, H12, H16, H15 H12, H15, H16
37 C17, C18, C19 H17, H16, H20, H19 H16, H19, H20
38 C21, C22, C23 H21, 20, 24, 23 H20, H23, H24
39 C25, C26, C27 H25, H24, H28, H27 H24, H27, H28
40 C29, C30, C31 H29, H28, H32, H31 H28, H31, H32
41 131,2 (s)
42 25,7 (q) 1,68 (3H, s) C33, C41, C43 H32, H33 H33, H43, H32 43 17,7 (q) 1,62 (3H, s) C33, C41, C42 H32, H33 H42, H32 a đo trong CDCl3, 125 MHz; b đo trong CDCl3, 500 MHz; TMS là chất chuẩn nội.
Phổ ESI-MS cho peak ion giả phân tử m/z 603,0 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C43H70O . Từ dữ liệu phổ và các phân tích trên, hợp chất BM.04 đƣợc xác định là bombiprenone, hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ chi Brucea.
36
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.04
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.04
37
Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất BM.04 3.3.1.5 Hợp chất BM.05: α-tocopherol (MC221)
Hợp chất BM.05 thu được dưới dạng bột màu đỏ, Rf = 0,17 (n-hexan:EtOAc 20/1), hiện UV254.
Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy có 29 cacbon trong đó có 8 nhóm metyl, 11 nhóm metylen, 3 nhóm metin và 7 cacbon không có liên kết hydro.
Dữ liệu phổ của BM.05 còn cho thấy sự xuất hiện một vòng thơm bị thế hoàn toàn tại δC 117,4 (C4a); 118,5 (C5); 144,5 (C-6); 121,0 (C-7); 122,6 (C-8) và 145,6 (C-8a). Các cacbon C-6 và C-8a chuyển dịch về trường thấp, chứng tỏ có gắn với dị tố có độ âm điện lớn, các cacbon khác có các nhóm thế metyl tại δC 11,3 (C-5a); 12,2 (C-7a); 11,8 (C-8b) và một nhóm metylen tại δC 20,8 (C- 4). Các phân tích trên đã gợi ý trong phân tử của hợp chất BM.05 tồn tại nhân croman.
Bảng 3.3. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo
STT BM.05
δC (ppm)
(CDCl3, 125 MHz, TMS)
α-tocopherol δC (ppm)
(CDCl3, 25,2 MHz, TMS) 1
2 74,5 74,3
2a 23,8 23,8
3 31,6 31,6
4 20,8 20,8
4a 117,4 117,0
5 118,5 118,5
5a 11,3 11,2
6 144,5 144,4
7 121,0 121,0
38
7a 12,2 12,1
8 122,6 122,3
8a 145,6 145,4
8b 11,8 11,8
1' 39,8 39,8
2' 21,1 21,0
3', 5', 7', 9' 37,3 - 37,5 37,5
4', 8' 32,8 32,7
4'a, 8'a 19,8 19,7
6' 24,5 24,5
10' 24,8 24,8
11' 39,4 39,4
12' 28,0 28,0
12'a 22,6 22,6
13' 22,7 22,6
Khi so sánh dữ liệu phổ của BM.05 với dữ liệu phổ của α-tocopherol trong tài liệu tham khảo [110], ta thấy chúng hoàn toàn phù hợp. Vì vậy ta có thể khẳng định BM.05 là α-tocopherol, CTPT C29H50O2. Hợp chất này có khả năng chống ôxy hóa mạnh và tiêu diệt các gốc tự do [111, 112] và lần đầu tiên tách ra từ chi Brucea.
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.05
39
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.05
Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất BM.05
Bảng 3.4. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm
40 BM.01 (12N)
Octatriacontan-1-ol
(lần đầu tiên phân lập từ chi Bruea)
BM.02 (MC218) Tetratriacontan-1-ol
(lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea)
BM.03 (3R, 12K) Stigmast-5,22-dien-3--ol
BM.04 (MC220) Bombiprenone
(lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea)
BM.05 (MC221) α-tocopherol
(lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea)
Từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall.ex Kurz ) phân lập đƣợc 5 hợp chất. Trong đó, có 4 hợp chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ chi Brucea (BM.01,
BM.02, BM.04, BM.05. .
41
41
Bảng 3.5. Bảng tổng kết các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) Stt Ký
hiệu 1
Ký
hiệu 2 Lớp chất k/l
(mg) Tên chất CTPT,
KLPT (g/mol)
Bộ phận
cây
Cấu trúc
1 BM.01 12N
Chất béo
22 Octatriacontan-1-ol C38H77OH (550)
lá
2 BM.02 MC218 24 tetratriacontan-1-ol C33H67OH (479)
lá
3 BM.04 MC220 70 Bombiprenone C43H70O (602)
lá
4 BM.05 MC221 75 α-tocopherol C29H50O2
(430)
lá
5 BM.03 3R,
12K Steroit 500 Stigmast-5,22-dien-3-
-ol C29H58O (422)
lá
42
3.4 Hoạt tính sinh học của các hợp chất đƣợc phân lập
Các hợp chất BM.02 05 đƣợc thử hoạt tính gây độc tế bào đối với bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thƣ máu cấp tính).
Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu. Sau quá trình xử lí số liệu bằng phần mềm Table Curve, các giá trị IC50
đã được tính toán và cho thấy độ tin cậy cao (r2 ≥ 0,99 tương ứng sai số <0,01). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất đƣợc tách ra trên bốn dòng ung thƣ
Hợp chất Giá trị IC50 (g/ml)
trên bốn dòng tế bào ung thƣ khác nhau
HL-60 LU-1 KB LNCaP
BM.02 > 20 > 20 > 20 > 20
BM.03 > 20 > 20 > 20 > 20
BM.04 > 20 > 20 > 20 > 20
BM.05 > 20 > 20 > 20 > 20
Ellipticine 0,66 0,72 0,89 0,697
.
Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy các hợp chất đƣợc thử đều có hoạt tính trên tất cả các dòng nghiên cứu vì vậy có thể lựa chọn để tiến hành tìm hiểu hoạt tính sâu hơn nữa trên động vật và lâm sàng.
Khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên hai dòng LU và KB, kết quả nhƣ sau:
43
Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc hoạt tính độc tế bào trên hai dòng tế bào LU và KB.
Mẫu LU KB
OD trung bình % ức chế OD trung bình % ức chế
MC 218 0.364 7.01 1.555 -3.04
MC 220 0.291 29.44 1.535 -1.64
MC 221 0.279 33.03 1.546 -2.43
Elipticine 0.063 99.39 0.091 99.23
DMSO 0.387 DMSO 1.512
O day 0.061 O day 0.080
Sau khi tiến hành sàng lọc trên hai dòng tế bào LU và KB chúng tôi nhận thấy hoạt tính của các chất không mạnh, điều này dễ hiểu và phù hợp với cấu trúc hóa học là những ancol mạch dài, chất béo của chúng.