Kiểm tra phổ kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 cho thấy, dịch chiết sinh khối hoàn toàn không ức chế các vi sinh vật kiểm định, chứng tỏ các chủng xạ khuẩn đã sinh tổng hợp chất kháng sinh và tiết vào môi trƣờng nuôi cấy. Dịch chiết từ dịch lên men của 2 chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định ở mức độ khác nhau.
Cả hai chủng NA113 và NA115 đều sinh chất kháng sinh kháng đƣợc nhiều chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, S. epidermidis ATCC 12228, S. typhi IFO14193, E. coli ATCC 11105 và C. albicans ATCC 10321; trong khi đó không kháng đƣợc 2 chủng vi sinh vật kiểm định là A. faecallis và P. auroginosa. Với vi sinh vật kiểm định là E. aerogenes
ATCC 13048 chỉ có chủng NA113 kháng đƣợc với vòng kháng khuẩn 13 mm. Kết quả thu đƣợc về phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113 và S. tendae NA115 mở ra tiềm năng ứng dụng sản xuất thuốc dùng trong y dƣợc.
Bảng 3.15. Phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113 và S. tandae NA115
Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vòng đối kháng (mm)
NA113 NA115 B. subtilis ATCC 6633 25 24 B. cereus ATCC 21778 14 21 S. epidermidis ATCC 12228 26 22 E. coli ATCC 11105 22 17 E. aerogenes ATCC 13048 13 - A. faecallis - - S. typhi IFO 14193 15 19 P. auroginosa - - C. albicans ATCC 10231 9 15
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất, nƣớc, bùn thu thập từ các vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh và Nghệ An đã phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn, trong đó 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh. Chủng NA113 và NA115 có hoạt tính kháng sinh cao đƣợc chọn tiếp tục nghiên cứu
2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kết hợp giải trình tự gene mã hóa 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA113 thuộc loài S. scabies và đặt tên là S. scabies
NA113. Chủng có khả năng sinh trƣởng tốt với nguồn nitơ hữu cơ nhƣ cao nấm men, trypton, pepton. pH thích hợp từ 7 – 10. Chủng sinh trƣởng tốt ở nồng độ NaCl từ 1 – 5% và nhiệt độ 30o
C.
3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và giải trình tự gene 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA115 thuộc loài S. tendae và đặt tên là S. tandae
NA115. Chủng thích hợp với pH 6 – 10, nồng độ NaCl 1 – 3% và nhiệt độ 30oC. 4. Hai chủng S. scabies NA113 và S. tendae NA115 đều có khả năng kháng lại 6 chủng vi sinh vật kiểm định là B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778,
S. epidemidis ATCC 12228, C. albicans ATCC 10231. E. coli ATCC 11105, S. typhi IFO 14193. Ngoài ra chủng NA113 còn kháng đƣợc vi khuẩn E. aerogenes
ATCC 13048.
5. Môi trƣờng thích hợp để chủng NA113 sinh chất kháng sinh là môi trƣờng MT7; pH 7 và thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20% thể tích bình. Trong khi đó môi trƣờng thích hợp cho chủng NA115 là M1-ASW; pH 7 và thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20 – 25% thể tích bình là thích hợp nhất cho quá trình lên men.
ĐỀ NGHỊ
1. Khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh. 2. Nghiên cứu tách chiết các chất kháng sinh từ 2 chủng xạ khuẩn biển S. scabies NA113 và S. tendae NA115, thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất kháng sinh thu đƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp – các chất kháng sinh. Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội.
2. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học
– tập 1, NXB KH và KT, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - tập 3, NXB KH và KT, Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
5. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội.
6. Nguyễn Nhƣ Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
7. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN và CN Quốc Gia, Hà Nội.
8. Lê Gia Hy và cs (2005), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn biển HT0523”, Những vấn đề cơ bản trong nghiên cứu khoa học sự sống định hướng y học, 549-552, NXB KHKT, Hà Nội.
9. Bùi Minh Lý, Ngô Quyền Bƣu, Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất Fucoidan từ rong nâu Việt Nam”, Tuyển tập các báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học Biển Đông.
10. Chu Văn Mẫn (2011), Tin học trong Công nghệ Sinh học, NXB Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội.
11. Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ Sinh học, viện CNSH, viện KH và CN Việt Nam, Hà Nội.
12. Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, (2009), “Bƣớc đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của một số loài rong biển Khánh Hòa”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 825- 830.
13. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội.
TIẾNG ANH
14. Carlos O., Carmen M., José A. S. (2009), “Antitumor Compounds from Marine Actinomycetes”, Marine Drugs, 7, 210-248.
15. Demain A. L. (1981), Industrial Microbiology, Science 214, 987 – 995. 16. George P. R. (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and
Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712.
17. Isoken Nekpen Henrietta Ogunmwonyi (2010), Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach, Master of Science in Microbiology, Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa.
18. James B. M., Arjun H. B., Romila D. C., Gerhard S., Emmanuel Z., Mahmood P., Jeffrey J., Valerie S. B., Mustapha A., Chris M. F., Xidong F., Zhizi Z., Guy T. C. (2008), “Biosynthesis of Diazepinomicin/ECO-4601, a Micromonospora Secondary Metabolite with a novel ring system”; J. Nat. Prod, 71, 1585-1590.
19. Jin Xiong (2006), Essential Bioinformatics, Cambridge University press, New York.
20. Kamerua Masahiro and Moris Kates (1999), “Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae”, Bioscience Biotechnology Biochem, 63(6), 969-972.
21. Keswanit J. and Whitman W.B. (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678.
22. Kin S Lam (2006), “Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes”, Current Opinion in Microbiology, 245-251.
23. Krishnaraj M., Mathivanan N. (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 3.
24. Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand. 25. Paul R. Jensen, Dwight R., and Fenical W. (1991), “Distribution of
Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 57, No. 4, 1102-1108.
26. Paul R. Jensen, Tracy J. Mincer, Philip G. Williams, William Fenical (2005), “Marine actinomycete diversity and natural product discovery”,
Antonie van Leeuwenhoek, 43-48.
27. Robert S., E. G. D. Murray, Nathan R. (1957), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, 7th, Williams & Wilkins, 744-822.
28. Rofiq Sunaryanto, Bambang Marwoto (2010), “Marine actinomycetes screening of Banten west coast and their antibiotics purification”
29. Sambrook J. and Rusell W.D. (2001), Molecular cloning – Laboratory manual, vol 2, 3nd, pp 8.4 – 8.25, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Newyork.
30. Shirling E.B., Gottlieb D. (1966) International of systematic bacteriology: Method for characterization of Streptomyces species. Derpartment of Botany and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois.
31. Stanley T. Williams et al. (1989), Bergey’s Mannual® of Systematic Bacteriology. Williams & Wilkins Vol. 4, 2452-2492.
32. Sumei Li, Xinpeng Tian, Siwen Niu, Wenjun Zhang, Yuchan Chen, Haibo Zhang, Xianwen Yang, Weimin Zhang, Wenjun Li, Si Zhang, Jianhua Ju, Chángheng Zhang (2011) “Pseudonocardians A-C, New diazaanthraquinone derivatives from a deap-sea actinomycete Pseudonocardia sp. SCSIO 01299”
Marine Drugs, 9, 1428-1439.
33. Turk biol (2003), Investigaion of the Antimicrobial Activity of some Streptomyces Isolates, No 27, 79-84.
34. Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena A (2012), “Antimicrobial potential of actinomycetes species isolated from marine environment”, Asian Pacific Journal og Tropical Biomedicine, 469-473.
35. Vijaya Baskara Sethubathi G. and Ashok Prabu V. (2010), “Antibacterial activity of Cyanobacterial species from Adirampattinam coast southeast coast of Palk bay”, Current research Journal of Biological Sciences 2(1), 24- 26.
36. Waksman, S.A. (1961), “Classification, identification and description of genera and species”, The Actinomycetes, vol 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore.
PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN
STT
Ký hiệu
mẫu Mẫu và vị trí lấy mẫu Địa điểm Số mẫu
1 HLN1 Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm tại Hạ Long Quảng Ninh 2
2 HLN2 Mẫu nƣớc mặt sâu 1 m tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 3
3 HLN3 Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm ven đảo trên vịnh
Hạ Long
Quảng Ninh 2
4 HLN4 Mẫu nƣớc biển xa bờ trong vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
5 HLB1 Mẫu bùn đất tại đảo trên vịnh Hạ Long Quảng Ninh 6
6 HLB2 Mẫu bùn đất tại đảo trên vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
7 HLB3 Mẫu đất ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
8 HLC1 Mẫu đất ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
9 HLC2 Mẫu đất cát ven bờ đảo tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 1
10 VD1 Mẫu nƣớc mặt xa bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
11 VD2 Mẫu nƣớc ven bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
12 VD3 Mẫu đất bùn xa bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
13 VD4 Mẫu cát ven bờ tại Vân Đồn Quảng Ninh 2
14 HLS1 Mẫu cát sỏi tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
15 HLS2 Mẫu cát sỏi tại vịnh Hạ Long Quảng Ninh 2
16 BB1 Mẫu bọt biển tại ven đảo thuộc vịnh Hạ
Long
Quảng Ninh 2
17 HPB4 Mẫu đất bùn tại bãi rừng ngập mặn ở Cát Bà Hải Phòng 2
18 HPB5 Mẫu đất bùn tại bãi rừng ngập mặn ở Cát Bà Hải Phòng 1
19 HPN5 Mẫu nƣớc ven bờ đảo tại đảo Cát Bà Hải Phòng 2
20 HPN6 Mẫu nƣớc xa bờ tại đảo Cát Bà Hải Phòng 2
21 HPC3 Mẫu nƣớc tại chân đê biển Ngọc Hải, Đồ
Sơn
Hải Phòng
2
22 HPC4 Mẫu đất bùn tại chân đê biển Ngọc Hải, Đồ
Sơn
Hải Phòng
2
23 IM1 Mẫu bọt biển tại Cát Bà Hải Phòng 2
24 IM2 Mẫu bùn tại rừng ngập mặn nằm cạnh đê
biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
25 IM3 Mẫu nƣớc tại rừng ngập mặn nằm cạnh đê
biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
26 IM4 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
28 IM6 Mẫu đất ven bờ tại đảo Hòn Dáu, Đồ Sơn Hải Phòng 2
29 CBD1 Mẫu nƣớc ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
30 CBD2 Mẫu nƣớc xa bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
31 CBD3 Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
32 CBS3 Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Hải Phòng 2
33 VK1-2 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2 34
VK2-2 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
35 VK3-1 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
1
36 VK4-1 Mẫu nƣớc và lá cây tại rừng ngập mặn nằm
cạnh đê biển Ngọc Hải
Hải Phòng
2
37 NA1 Mẫu nƣớc mặt xa bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An
2
38 NA2 Mẫu nƣớc mặt ven bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An
2
39 VK1-1 Mẫu đất, bùn ven bờ tại Diễm Châu, Cửa
Lò
Nghệ An
2
PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI
(đơn vị g/l)
1. Môi trƣờng Gause 1: Tinh bột – 10; (NH4)2SO4 – 1; MgSO4.7H2O – 1; CaCO3 – 3; pH 7 ± 0,3.
2. Môi trƣờng Gause 2 (g/l): Nƣớc chiết thịt – 30 ml; Pepton – 5; NaCl – 5; Glucose – 10; pH 7 – 7,2.
3. Môi trƣờng ISP1: Triptone – 5; yeast extract – 3; pH 7
4. Môi trƣờng ISP2: Yeast extract – 4; Malt extract – 10; Destrose– 4; pH 7,3 5. Môi trƣờng ISP3: Bột lúa mạch – 20; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 6. Môi trƣờng ISP4: Tinh bột – 10; K2HPO4.2H2O – 1; MgSO4.7H2O – 1; NaCl – 1; (NH4)2SO4 – 2; CaCO3 – 2; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 - 7,4.
7. Môi trƣờng ISP5: L-Asparagine – 1; Glycerol – 10ml; K2HPO4 – 1; dung dịch khoáng A - 1ml; pH 7,0 – 7,4.
8. Môi trƣờng ISP6: Pepton – 19,7; Feric amonium citrat – 0,49; Na2S2O4 – 0,97; K2HPO4 - 0,98; Yeast extract – 1; pH = 7 ± 0,2
9. Môi trƣờng ISP7: Glycerol – 15; L-Tyrozine – 0,5; L-Asparagine – 1; K2HPO4 – 0,5; MgSO4.7H2O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO4.7H2O – 0,01; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 – 7,4.
10. Môi trƣờng ISP8: D-Glucose – 10; MgSO4.7H2O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO4.7H2O – 0,01; K2HPO4 – 1; nguồn nitơ – 1%
11. Môi trƣờng ISP9: (NH4)2SO4 – 2,64; KH2PO4 – 2,38; K2HPO4.3H2O – 5,65; MgSO4.7H2O – 1; dung dịch khoáng B – 1ml; nguồn đƣờng – 1%; pH 6,8 – 7.
12. Môi trƣờng SCA: Tinh bột – 10; Casein – 1; KH2PO4 – 0,5; MgSO4 – 0,5; NaCl – 3; pH 7,6
13. Môi trƣờng MPA: Meat extract – 3; Pepton – 5; NaCl – 5; pH 6,5 – 7 14. Môi trƣờng LB: Yeast extract – 5; Tryptone – 10; NaCl – 5; pH 7.
15. Môi trƣờng Hansen: Glucose – 20; Pepton – 10; KH2PO4 – 2; MgSO4 – 2; Yeast extract – 3.
16. Môi trƣờng xạ khuẩn: Malt extract – 10; Yeast extract – 4; Glucose – 4; pH 7 ± 0,2.
17. Môi trƣờng nƣớc biển: Meat extract – 10; Pepton – 10; nƣớc cất – 250ml; nƣớc biển – 750ml.
18. Môi trƣờng 7: Tinh bột – 10; Glucose – 5; Pepton – 6; (NH4)2SO4 – 2,5; CaCO3 – 2.
19. Môi trƣờng 79: Glucose – 10; Pepton – 10; Casein – 2; Yeast extract – 2; NaCl – 6; K2HPO4 – 0,2.
20. Môi trƣờng A4: Glucose – 10; Bột đậu tƣơng – 10; NaCl – 5; CaCO3–1. 21. Môi trƣờng A4H: Glucose – 15; Bột đậu tƣơng – 15; NaCl – 5; CaCO3-1 22. Môi trƣờng TH4-47: Tinh bột – 15; Glucose – 10; Lactose – 30; Bột đậu tƣơng – 30; (NH4)2SO4 – 5.
23. Môi trƣờng MN1-ASW: Glucose – 0,25; Yeast extract – 0,25; Malt extract – 0,64.
24. Môi trƣờng M1-ASW: Tinh bột – 10; Yeast extract – 4; Pepton – 2. 25. Môi trƣờng 48: Yeast extract – 2; Tinh bột – 10.
26. Môi trƣờng MPG: Pepton – 3; Glucose – 10; Casein – 2; Tinh bột – 2. 27. Môi trƣờng MPM: Pepton – 5; Manitol – 10.
28. Môi trƣờng khoai tây: Khoai tây - 20.
29. Bennett cải tiến: Meat extract – 1; Glucose – 10; Bactocasaminoacid – 2; Yeast extract – 1; pH 7,3.
30. Dung dịch khoáng A: FeSO4.7H2O – 1; MnCl2.4H2O –1; ZnSO4.7H2O–1. 31. Dung dịch khoáng B: FeSO4.7H2O – 1,1; CuSO4.5H2O – 6,4; MnCl2.4H2O – 7,9; ZnSO4.7H2O – 1,5.
PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH
Tên chủng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh Gram Điều kiê ̣n
Escherichia coli ATCC 11105 - Hiếu khí không bắt buô ̣c
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 + Hiếu khí không bắt buô ̣c
Bacillus subtilis ATCC 6633 + Hiếu khí
Alcaligenes faecallis - Hiếu khí
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 - Hiếu khí không bắtt buô ̣c
Bacillus cereus ATCC 11778 + Kị khí không bắt buộc
Sarcina lutea M5 + Kị khí không bắt buộc
Klebsiella pneumoniae - Kị khí không bắt buộc
PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA
Chủng NA115
1 cattcacgga gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc 61 aagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg