3.4.2.1. Kết quả tách DNA tổng số
Trƣớc khi tiến hành tách DNA tổng số, chúng tôi cấy xạ khuẩn trên môi trƣờng ISP2 (dịch thể), ở nhiệt độ 30oC, sau 48 giờ thu sinh khối. DNA đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và cs có cải tiến. Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra điện di trên gel agarose 1% đƣợc thể hiện trong hình sau:
1 2 3 4
Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn trên gel agarose 1%: băng 1 và 2: DNA của chủng NA113; băng 3 và 4: DNA của chủng NA115.
DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 đƣợc tách và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả điện di cho thấy đoạn gene trên bản điện di xuất hiện là băng có kích thƣớc khá rõ nét. Đo quang phổ ở bƣớc sóng 260 và 280 nm cho thấy hệ số đạt đƣợc của chủng NA113 là 1.88 và chủng NA115 là 1,96. Nhƣ vậy, có thể nói rằng DNA thu đƣợc trong quá trình tách chiết đã đạt yêu cầu và có thể tiếp tục tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.2. Kết quả nhân gene mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR
Để phân loại định tên chính xác chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nhân gene mã hóa 16S-rRNA để làm cơ sở phân tích trình tự. Đây là một gene chỉ thị đƣợc dùng phổ biến trong phân loại vi sinh vật. Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân gene là FC27 và RC1492. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (M: thang ADN chuẩn 1 kb; băng 1: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113,
băng 2: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115).
Kết quả điện di trên hình 3.10 cho thấy sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, không có sản phẩm phụ. Dựa vào thang DNA chuẩn cho thấy, sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb tƣơng ứng với kích thƣớc khi tính toán chọn cặp mồi đặc hiệu. Do đó có thể kết luận đoạn DNA đƣợc nhân lên chính là gene mã hóa 16S- rRNA của chủng NA113 và NA115. Kết quả này là cơ sở để chúng tôi tiến hành tách dòng giải trình tự và phân loại chủng xạ khuẩn này.
3.4.2.3. Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với gene mã hóa 16S-rRNA, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen).
Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng xạ khuẩn NA113 hai chiều tại phòng TNTĐCNG - viện Công nghệ sinh học, đƣợc so sánh với các trình
tự gene tƣơng ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA113 có độ tƣơng đồng cao trên 99% so với gene tƣơng ứng của chủng thuộc loài S. scabies.
Bảng 3.10. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA113 với gene tƣơng ứng của các chủng xạ khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank
Trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ
khuẩn đƣợc so sánh Acc. No.
Độ tƣơng đồng (%)
Chủng S. scabies RL-34 NR_025865.1 100
Chủng S. scabies 8722 AB026202.1 100
Chủng Streptomyces sp. WI03-4c EU080962.1 99
Chủng Streptomyces sp. EF-35 AF112154.1 99
Chủng S. scabies R90-3 AB026205.1 99
Chủng S. scabies RB2 AB026204.1 99
Chủng S. scabies CEK-037 AB026206.1 99
Chủng S. scabies D63864.1 99
Chủng S. scabies D63863.1 99
Chủng Streptomyces sp. SDT-5 AM889489.1 99
Chủng Streptomyces sp. NM-15 AM889481.1 99
AB026205.1|S.scabies R90-3 AB026206.1|S.scabies CEK-037 AF112154.1|Streptomyces sp.EF-35 D63862.1|S. scabies NA113 NR 074848.1|S. scabies 87.22 NR 025865.1|S.scabies RL-34 EU080962.1|Streptomyces sp.WI03-4c D63864.1|S.scabies
Hình 3.11. Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn. Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng xạ khuẩn NA115 hai chiều đƣợc so sánh với các trình tự gene tƣơng ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115 có độ tƣơng đồng cao tới 100% so với gene tƣơng ứng của chủng S. tendae ATCC 19812, S. tendae NBRC 12822 và S. tendae KSI 1700 (Bảng 3.11).
Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA115 với gene tƣơng ứng của các chủng xạ khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank
Trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn đƣợc so sánh
Acc. No.
Độ tƣơng đồng (%)
Chủng S. tendae ATCC 19812 NR_025871.1 100
Chủng không nuôi cấy đƣợc D1B5 HM131970.1 100
Chủng Streptomyces sp. 1A01559 EF012090.1 99
Chủng S. tendae 13661U EU741192.1 100
Chủng S. lividans rrnB Y00484.1 99
Chủng xạ khuẩn R03 AY944262.1 99
Chủng Streptomyces sp. OAct 28 JX047030.1 99
Chủng Streptomyces sp. ME01-18h EU080950.1 99
Chủng S. tendae NBRC 12822 AB184172.1 100
Chủng Streptomyces sp. 3194 DQ663150.1 99
Chủng Streptomyces sp. 223116 GU130100.1 99
Kết hợp kết quả phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113 và NA115 với kết quả thu đƣợc khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 chủng xạ khuẩn này, đặt tên chủng là S. scabiesNA113 và S. tendae NA115.
EF012090.1|Streptomyces sp. 1A01559 FJ267618.1|Streptomyces sp. 216802 FJ267617.1|Streptomyces sp. 216801 JX047063.1|Streptomyces sp. OAct27 JQ819729.1|S. tendae AM13 NR042829.1|Streptomyces sp. 40002 NR042760.1|Streptomyces sp. 40003
EU741192.1|S. tendae 13661U
HM594286.1|S. tendae M23
KC292819.1|S. tendae C-4
NA115
NR025871.1|S. tendae ATCC19812
Hình 3.12. Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn.
3.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên men tới khả năng sinh chất kháng sinh của chủng S. scabies NA113 và S. tendae NA115.
3.5.1. Lựa chọn môi trường lên men
Trong quá trình lên men, việc lựa chọn môi trƣờng thích hợp là một yếu tố quyết định đến hoạt tính kháng sinh thu đƣợc. Để chọn đƣợc môi trƣờng lên men đáp ứng đƣợc yêu cầu trên, chúng tôi sử dụng các loại môi trƣờng lên men cơ bản. Kết quả lên men đƣợc thể hiện ở bảng 3.12, vi sinh vật kiểm định B. subtilis ATCC 6633.
Bảng 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 trên các môi trƣờng lên men khác nhau
Chủng xạ khuẩn
Môi trƣờng lên men, Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm)
48 MT7 79 M1-ASW A4H MPM MPG
NA113 8 23 17 9 14 7 14
NA115 12 - 16 23 22 - -
Chủng NA113 có hoạt tính mạnh nhất khi lên men ở môi trƣờng MT7 với vòng kháng khuẩn là 23 mm, chủng NA115 sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh nhất ở môi trƣờng M1-ASW với vòng kháng khuẩn 23 mm, trong khi đó ở các môi trƣờng MT7, MPG và MPM chủng NA115 không có hoạt tính. Môi trƣờng MT7 và M1-ASW đƣợc lựa chọn để lên men 2 chủng xạ khuẩn này trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ
Những hiểu biết về thành phần môi trƣờng lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vô cơ, các chất kích thích hoặc kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh) cũng nhƣ ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy khác (nhƣ pH, nhiệt độ, độ thông khí, đặc điểm của chủng giống) có ý nghĩa to lớn trong điều khiển quá trình lên men nhằm duy trì trạng thái hoạt động và có thể kéo dài pha sinh tổng hợp của chủng sản xuất. Trên cơ sở các môi trƣờng lên men đã lựa chọn đƣợc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ tới khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn. Chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng trong các thí nghiệm là B. subtilis ATCC 6630.
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng NA113 và NA115
Khả năng sinh trƣởng và sinh chất kháng khuẩn (D-d, mm)
Nguồn cacbon NA113 NA115
Glucose ++ 18 ++ 17 Maltose + 21 + 20 Tinh bột ++ 23 ++ 24 Dextrose + 19 + 20 Saccarose + 20 + 19 Nguồn nitơ NH4Cl ± 10 - 0 (NH4)2SO4 - 0 - 0 Yeast extract + 20 ++ 21 Casein ++ 23 ++ 20 Pepton + 19 ++ 25 Trypton + 19 ++ 21 Cao ngô ± 11 ± 9 Bột đâu tƣơng ++ 23 ++ 23 Khô lạc ± 10 ± 10 Malt extract ± 10 ± 9
Ghi chú:+ Sinh trưởng bình thường; - Không sinh trưởng; ± Sinh trưởng yếu; ++ Sinh trưởng tốt
Kết quả cho thấy chủng xạ khuẩn NA113 triển tốt trên môi trƣờng có nguồn cacbon là tinh bột, glucose. Nguồn cacbon tốt nhất để tạo chất kháng sinh là tinh bột với vòng kháng khuẩn là 23 mm và hoạt tính kháng sinh kém nhất khi sử dụng nguồn cacbon là glucose với vòng kháng khuẩn là 18 mm. Bột đậu tƣơng và casein là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng sinh của chủng NA113 với vòng kháng khuẩn 23 mm. Trên môi trƣờng nitơ vô cơ, chủng này sinh trƣởng yếu và hoạt tính kháng sinh yếu hoặc không có.
Tinh bột là nguồn cacbon thích hợp nhất cho sinh trƣởng và tổng hợp chất kháng sinh của chủng NA115 (VKK là 24 mm); nguồn nitơ thích hợp nhất là pepton
với vòng kháng khuẩn 25 mm. Chủng này không sinh trƣởng trên môi trƣờng có nitơ vô cơ.
3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí
Độ thoáng khí và pH ban đầu có vai trò quan trọng trong quá trình tạo chất kháng sinh. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng lên men đã lựa chọn ở trên, với pH khác nhau (từ 5 - 9). Để xác định ảnh hƣởng của độ thoáng khí tới sinh tổng hợp chất kháng sinh, chúng tôi thay đổi thể tích dịch nuôi trong bình có dung tích 500ml để ôxi có thể khuếch tán vào trong, từ đó xác định đƣợc thể tích môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất.
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng NA113 và NA115
pH NA113 NA115 5 15 13 6 22 19 7 28 27 8 20 15 9 15 11 Độ thoáng khí (%, v/v) 10 15 13 15 22 19 20 28 27 25 26 27 30 15 19
Kết quả cho thấy cả hai chủng đều có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất khi môi trƣờng có pH 7, chủng NA113 có hoạt tính kháng B. subtilis ATCC6633 với đƣờng kính vòng kháng khuẩn 28 mm và vòng kháng khuẩn của chủng NA115 là 27 mm.
Thể tích môi trƣờng chiếm 20 – 25% thể tích bình nuôi cho hiệu quả tổng hợp chất kháng sinh cao nhất. Chủng NA113 có vòng kháng khuẩn 28 mm khi có lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 20% và 26 mm với lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 25%
thể tích bình. Chủng NA115 có hoạt tính mạnh nhất khi lƣợng dịch nuôi chiếm 20 – 25% thể tích bình lên men với vòng kháng khuẩn là 27 mm.
3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Kiểm tra phổ kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 cho thấy, dịch chiết sinh khối hoàn toàn không ức chế các vi sinh vật kiểm định, chứng tỏ các chủng xạ khuẩn đã sinh tổng hợp chất kháng sinh và tiết vào môi trƣờng nuôi cấy. Dịch chiết từ dịch lên men của 2 chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định ở mức độ khác nhau.
Cả hai chủng NA113 và NA115 đều sinh chất kháng sinh kháng đƣợc nhiều chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, S. epidermidis ATCC 12228, S. typhi IFO14193, E. coli ATCC 11105 và C. albicans ATCC 10321; trong khi đó không kháng đƣợc 2 chủng vi sinh vật kiểm định là A. faecallis và P. auroginosa. Với vi sinh vật kiểm định là E. aerogenes
ATCC 13048 chỉ có chủng NA113 kháng đƣợc với vòng kháng khuẩn 13 mm. Kết quả thu đƣợc về phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113 và S. tendae NA115 mở ra tiềm năng ứng dụng sản xuất thuốc dùng trong y dƣợc.
Bảng 3.15. Phổ kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn S. scabies NA113 và S. tandae NA115
Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vòng đối kháng (mm)
NA113 NA115 B. subtilis ATCC 6633 25 24 B. cereus ATCC 21778 14 21 S. epidermidis ATCC 12228 26 22 E. coli ATCC 11105 22 17 E. aerogenes ATCC 13048 13 - A. faecallis - - S. typhi IFO 14193 15 19 P. auroginosa - - C. albicans ATCC 10231 9 15
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất, nƣớc, bùn thu thập từ các vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh và Nghệ An đã phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn, trong đó 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh. Chủng NA113 và NA115 có hoạt tính kháng sinh cao đƣợc chọn tiếp tục nghiên cứu
2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kết hợp giải trình tự gene mã hóa 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA113 thuộc loài S. scabies và đặt tên là S. scabies
NA113. Chủng có khả năng sinh trƣởng tốt với nguồn nitơ hữu cơ nhƣ cao nấm men, trypton, pepton. pH thích hợp từ 7 – 10. Chủng sinh trƣởng tốt ở nồng độ NaCl từ 1 – 5% và nhiệt độ 30o
C.
3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và giải trình tự gene 16S- rRNA, đã phân loại đƣợc chủng NA115 thuộc loài S. tendae và đặt tên là S. tandae
NA115. Chủng thích hợp với pH 6 – 10, nồng độ NaCl 1 – 3% và nhiệt độ 30oC. 4. Hai chủng S. scabies NA113 và S. tendae NA115 đều có khả năng kháng lại 6 chủng vi sinh vật kiểm định là B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778,
S. epidemidis ATCC 12228, C. albicans ATCC 10231. E. coli ATCC 11105, S. typhi IFO 14193. Ngoài ra chủng NA113 còn kháng đƣợc vi khuẩn E. aerogenes
ATCC 13048.
5. Môi trƣờng thích hợp để chủng NA113 sinh chất kháng sinh là môi trƣờng MT7; pH 7 và thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20% thể tích bình. Trong khi đó môi trƣờng thích hợp cho chủng NA115 là M1-ASW; pH 7 và thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20 – 25% thể tích bình là thích hợp nhất cho quá trình lên men.
ĐỀ NGHỊ
1. Khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh. 2. Nghiên cứu tách chiết các chất kháng sinh từ 2 chủng xạ khuẩn biển S. scabies NA113 và S. tendae NA115, thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất kháng sinh thu đƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp – các chất kháng sinh. Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội.
2. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học
– tập 1, NXB KH và KT, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - tập 3, NXB KH và KT, Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
5. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội.
6. Nguyễn Nhƣ Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
7. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN và CN Quốc Gia, Hà Nội.
8. Lê Gia Hy và cs (2005), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn biển HT0523”, Những vấn đề cơ bản trong nghiên cứu khoa học sự sống định hướng y học, 549-552, NXB KHKT, Hà Nội.
9. Bùi Minh Lý, Ngô Quyền Bƣu, Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất Fucoidan từ rong nâu Việt Nam”, Tuyển tập các báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học Biển Đông.
10. Chu Văn Mẫn (2011), Tin học trong Công nghệ Sinh học, NXB Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội.
11. Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ Sinh học, viện CNSH, viện KH và CN Việt Nam, Hà Nội.
12. Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, (2009), “Bƣớc đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của một số loài rong biển Khánh Hòa”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 825- 830.