2.2.5.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ xạ khuẩn bằng đệm CTAB Nguyên tắc:
Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏi DNA nhờ protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằng phức hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1). Sau đó dịch có chứa DNA đƣợc tủa bằng Isopropanol và rửa bằng etanol. Cặn DNA đƣợc hòa tan trong đệm TE. Bảo quản ở -20o
C [29].
Quy trình:
Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8. Đảo đều bằng voltex. Bổ sung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM). Sau đó thêm 60 µl lysozym (50
mg/ml), ủ trong 2 giờ ở 65OC. Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10%. Đảo nhẹ, ủ 1 giờ ở 37O
C. Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhẹ. Bổ sung thêm 700 µl Chloroform : Isoamin alcohol (24:1), đảo đều sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới. Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3 lần).
Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -20oC. Li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch. Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối.
Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủ ở 37oC trong 2 giờ Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH 8
Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Bảo quản ở 4oC.
* Tinh sạch DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ ở bƣớc sóng 260 và 280 nm. Tính hệ số A = 260/280. Nếu hệ số chỉ từ 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu.
2.2.5.2. Phản ứng PCR và giải trình tự gene [29]
DNA tổng số sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc chạy PCR để tách đoạn gene 16S-rRNA với thành phần phản ứng nhƣ sau:
DNA template 1 µl H2O 11 µl dNTP (mỗi loại 0,2 mM) 0,8 µl Primer F 1 µl Primer R 1 µl MgCl2 1 µl Buffer 10x 4 µl Taq polymerase 0,2 µl Tổng thể tích 20 µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc chạy PCR với chƣơng trình nhƣ sau: 940C 5 phút 940C 1 phút 30 giây Lặp lại 30 lần 510C 1 phút 30 giây 720C 2 phút 720C 10 phút 40C Sử dụng cặp mồi FC27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và RC1492 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) (hãng GENSET- Singapore BioTech pte, Ltd) để nhân gene mã hóa 16S rRNA.
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Sản phẩm sau khi giải trình tự đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI. Cây phát sinh chủng loại đƣợc thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phƣơng pháp Neighbor-joining. Phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại đƣợc tính với 1000 mẫu thử [10, 19].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN