CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115
3.4.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
Trước khi tiến hành tách DNA tổng số, chúng tôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP2 (dịch thể), ở nhiệt độ 30oC, sau 48 giờ thu sinh khối. DNA được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và cs có cải tiến. Kết quả tách chiết được kiểm tra điện di trên gel agarose 1% đƣợc thể hiện trong hình sau:
1 2 3 4
Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn trên gel agarose 1%:
băng 1 và 2: DNA của chủng NA113; băng 3 và 4: DNA của chủng NA115.
DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 đƣợc tách và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả điện di cho thấy đoạn gene trên bản điện di xuất hiện là băng cú kớch thước khỏ rừ nột. Đo quang phổ ở bước súng 260 và 280 nm cho thấy hệ số đạt đƣợc của chủng NA113 là 1.88 và chủng NA115 là 1,96.
Nhƣ vậy, có thể nói rằng DNA thu đƣợc trong quá trình tách chiết đã đạt yêu cầu và có thể tiếp tục tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.2. Kết quả nhân gene mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR
Để phân loại định tên chính xác chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nhân gene mã hóa 16S-rRNA để làm cơ sở phân tích trình tự. Đây là một gene chỉ thị đƣợc dùng phổ biến trong phân loại vi sinh vật. Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân gene là FC27 và RC1492. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (M: thang ADN chuẩn 1 kb; băng 1: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113,
băng 2: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115).
Kết quả điện di trên hình 3.10 cho thấy sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, không có sản phẩm phụ. Dựa vào thang DNA chuẩn cho thấy, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước khi tính toán chọn cặp mồi đặc hiệu. Do đó có thể kết luận đoạn DNA đƣợc nhân lên chính là gene mã hóa 16S- rRNA của chủng NA113 và NA115. Kết quả này là cơ sở để chúng tôi tiến hành tách dòng giải trình tự và phân loại chủng xạ khuẩn này.
3.4.2.3. Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với gene mã hóa 16S-rRNA, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen).
Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng xạ khuẩn NA113 hai chiều tại phòng TNTĐCNG - viện Công nghệ sinh học, đƣợc so sánh với các trình
tự gene tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA113 có độ tương đồng cao trên 99% so với gene tương ứng của chủng thuộc loài S. scabies.
Bảng 3.10. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA113 với gene tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank
Trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ
khuẩn được so sánh Acc. No. Độ tương
đồng (%)
Chủng S. scabies RL-34 NR_025865.1 100
Chủng S. scabies 8722 AB026202.1 100
Chủng Streptomyces sp. WI03-4c EU080962.1 99
Chủng Streptomyces sp. EF-35 AF112154.1 99
Chủng S. scabies R90-3 AB026205.1 99
Chủng S. scabies RB2 AB026204.1 99
Chủng S. scabies CEK-037 AB026206.1 99
Chủng S. scabies D63864.1 99
Chủng S. scabies D63863.1 99
Chủng Streptomyces sp. SDT-5 AM889489.1 99
Chủng Streptomyces sp. NM-15 AM889481.1 99
Chủng S. scabies LM5MT-2 AB026210.1 99
AB026205.1|S.scabies R90-3
AB026206.1|S.scabies CEK-037
AF112154.1|Streptomyces sp.EF-35
D63862.1|S. scabies
NA113
NR 074848.1|S. scabies 87.22
NR 025865.1|S.scabies RL-34
EU080962.1|Streptomyces sp.WI03-4c
D63864.1|S.scabies
Hình 3.11. Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn.
Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng xạ khuẩn NA115 hai chiều được so sánh với các trình tự gene tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115 có độ tương đồng cao tới 100% so với gene tương ứng của chủng S.
tendae ATCC 19812, S. tendae NBRC 12822 và S. tendae KSI 1700 (Bảng 3.11).
Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng NA115 với gene tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank
Trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn đƣợc so sánh
Acc. No.
Độ tương đồng (%)
Chủng S. tendae ATCC 19812 NR_025871.1 100
Chủng không nuôi cấy đƣợc D1B5 HM131970.1 100
Chủng Streptomyces sp. 1A01559 EF012090.1 99
Chủng S. tendae 13661U EU741192.1 100
Chủng S. lividans rrnB Y00484.1 99
Chủng xạ khuẩn R03 AY944262.1 99
Chủng Streptomyces sp. OAct 28 JX047030.1 99
Chủng Streptomyces sp. ME01-18h EU080950.1 99
Chủng S. tendae NBRC 12822 AB184172.1 100
Chủng Streptomyces sp. 3194 DQ663150.1 99
Chủng Streptomyces sp. 223116 GU130100.1 99
Kết hợp kết quả phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113 và NA115 với kết quả thu đƣợc khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 chủng xạ khuẩn này, đặt tên chủng là S. scabies NA113 và S. tendae NA115.
EF012090.1|Streptomyces sp. 1A01559
FJ267618.1|Streptomyces sp. 216802
FJ267617.1|Streptomyces sp. 216801
JX047063.1|Streptomyces sp. OAct27
JQ819729.1|S. tendae AM13
NR042829.1|Streptomyces sp. 40002
NR042760.1|Streptomyces sp. 40003
EU741192.1|S. tendae 13661U
HM594286.1|S. tendae M23
KC292819.1|S. tendae C-4
NA115
NR025871.1|S. tendae ATCC19812
Hình 3.12. Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn.
3.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên men tới khả năng sinh chất kháng sinh của chủng S. scabies NA113 và S. tendae NA115.