Kỹ thuật khuếch đại ADN

4. ứng dụng sinh học phân tử trong xác định và nghiên cứu N.

4.2. Kỹ thuật khuếch đại ADN

Kỹ thụât khuếch đại acid nucleic có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Nhìn chung, kỹ thụât này có khá nhiều −u điểm. Tr−ớc hết, độ nhạy đ−ợc cải thiện rất nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông th−ờng. Khi so sánh với kỹ thuật khuếch đại acid nucleic, kỹ thuật nuôi cấy, phân lập có độ nhạy từ 85% đến 90% đối với tr−ờng hợp bị lậu cấp và chỉ có 50% đối với tr−ờng hợp lậu mạn tính. Nhờ có độ nhạy cao, kỹ thuật khuếch đại acid nucleic rất hiệu quả trong việc sàng lọc, chẩn đoán chính xác các tr−ờng hợp bị lậu kể cả tr−ờng hợp có và không có triệu chứng. Thứ hai, việc thu thập bệnh phẩm dùng cho kỹ thuật này không đòi hỏi yêu cầu đặc biệt giúp cho vi khuẩn phải còn sống giống nh− tr−ờng hợp nuôi cấy, phân lập. Cuối cùng, bệnh phẩm dùng cho kỹ thuật khuếch đại có thể đ−ợc lấy bằng các kỹ thuật không xâm nhập, hoặc ngay cả bệnh nhân cũng có thể cung cấp bệnh phẩm để làm xét nghiệm. Điều này đặc biệt có ích với các tr−ờng hợp bệnh nhân ở vùng sâu, vùng xa, hay vì các lý do về tôn giáo, tín ng−ỡng mà hạn chế việc lấy bệnh phẩm so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông th−ờng [9, 14].

Tuy nhiên, các kỹ thuật khuếch đại cũng có những hạn chế của nó. Các hạn chế này liên quan rất đặc biệt với đặc thù của kỹ thuật. Đó là giá thành đầu t− cho trang thiết bị, sinh phẩm, khả năng bị nhiễm trong quá trình thao tác, sản phẩm không đặc hiệu, hay thiếu thông tin về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn. Ngoài ra, trong một số tr−ờng hợp đặc biệt, những trình tự nucleotid là đích của quá trình khuếch đại có thể không có mặt trong một số chủng vi khuẩn hoặc là chúng xuất hiện ở cả những chủng Neisseria th−ờng có mặt trong đ−ờng sinh dục, tiết niệu. Điều này dẫn đến khả năng bị âm tính hoặc d−ơng tính giả tuỳ từng tr−ờng hợp.

Các kỹ thụât dựa vào việc khuếch đại acid nucleic có những khó khăn sau:

- ức chế trong kỹ thuật khuếch đại acid nucleic

+ Các chất ức chế

Một trong những hạn chế của kỹ thuật khuếch đại acid nucleic là chúng rất nhạy cảm với các chất ức chế có mặt trong bệnh phẩm của bệnh nhân. Những chất này bao gồm Beta-human, chorionic gonadotropin, các tinh thể, hemoglobin và các nitrite. Nếu không đ−ợc kiểm soát chặt chẽ, các chất này có thể gây ra kết quả âm tinh giả. Các chất ức chế rất hay gặp trong n−ớc tiểu, và rất hay ức chế quá trình khuếch đại acid nucleic. Hiện nay, nhiều kít chẩn đoán đã đ−ợc th−ơng mại hoá th−ờng có các chứng nội tại để dễ dàng phát hiện sự ức chế của các chất này. Việc sử dụng chứng nội vẫn còn là một vấn đề đối với các phòng xét nghiệm chẩn đoán hoặc các phòng thí nghiệm sử dụng kít tự phát triển. Việc do dự trong việc sử dụng chứng nội th−ờng liên quan đến việc tăng giá cho xét nghiệm chẩn đoán. Đặc biệt, nếu chứng nội đ−ợc sử dụng chạy riêng biệt với mẫu cần chẩn đoán. Nh− vậy, sinh phẩm và công việc th−ờng gấp đôi. Để khắc phục tình trạng này, nhiều nghiên cứu đã phát triển các kỹ thuật multiplex, trong đó, chạy cả chứng nội

cùng với mẫu cần chẩn đoán. Do vậy, cũng hạn chế đ−ợc những vấn đề về giá thành xét nghiệm. Tuy nhiên, nó cũng làm giảm độ nhạy của phản ứng. Nh− vậy, nếu không sử dụng chứng nội trong phát hiện N. gonorrhoeae, các phòng xét nghiệm có nguy cơ gặp phải tình trạng âm tính giả trong xét nghiệm. Gần đây, nhiều nhà nghiên cứu đã đề xuất việc sử dụng chứng nội bắt buộc trong quá trình chẩn đoán [44].

+ ức chế cạnh tranh

Một trong những điểm thuận lợi của các kit th−ơng mại áp dụng kỹ thuật khuếch đại acid nucleic trong xác định N. gonorrhoeae là ở chỗ, hầu hết các kít sử dụng phản ứng kép để phát hiện C. trachomatis và các chất ức chế (dùng chứng nội tại). Nh− vậy, về mặt lý thuyết, các phản ứng này có thể phát hiện và phân biệt sự xuất hiện của cả hai căn nguyên gây nhiễm trùng đ−ờng sinh dục tiết niệu và cả chất ức chế nếu có. Nh−ợc điểm của các kít này là sự khuếch đại cạnh tranh có thể xảy ra giữa các phản ứng khác nhau. Sự cạnh tranh này chủ yếu xảy ra khi mà nồng độ acid nucleic của một đoạn nucleotide đích nhiều hơn rất nhiều so với đoạn khác làm cho sự khuếch đại này bị giảm đi rất nhiều. Nh− vậy, sự đồng nhiễm của N. gonorrhoeae và C. trachomatis có thể không phát hiện đ−ợc bằng các phản ứng kép. Gaydos và cộng sự thấy rằng, trong số 56 tr−ờng hợp đồng nhiễm thì 6 tr−ờng hợp không phát hiện đ−ợc bằng bộ kít th−ơng phẩm Gen-Pro AC2. Trong đó, C. trachomatis phát hiện đơn thuần trong 2 tr−ờng hợp và N. gonorrhoeae phát hiện đơn thuần trong 4 tr−ờng hợp. Sự ức chế cạnh tranh cũng đ−ợc báo cáo trong hệ thông Roche Cobas Amplicor. Nhìn chung, vấn đề này cũng không phải là phổ biến. Tuy nhiên, có thể có hai lý do dẫn đến hiện t−ợng này. Tr−ớc tiên, sự đồng nhiễm hai căn nguyên này chỉ phổ biến ở một số vùng có tỷ lệ mắc cao đối với hai bệnh này và chỉ có một tỷ lệ nhỏ bệnh phẩm d−ơng tính trong nhiều nghiên cứu. Thứ hai, sự đồng nhiễm có thể không phát hiện

đ−ợc bởi những ph−ơng pháp sử dụng trong các nghiên cứu đó. Đó là vì nhiều nghiên cứu chỉ đơn thuần so sánh một kỹ thuật khuếch đại kép này với kỹ thụât khuếch đại kép khác và cả hai đều có chung một nh−ợc điểm này. Để xác định có phải là sự đồng nhiễm không đ−ợc phát hiện, nên sử dụng các ph−ơng pháp phát hiện riêng biệt từng căn nguyên để đánh giá [44].

+ Vấn đề giá cả và việc trộn các bệnh phẩm

Các kỹ thuật khuếch đại acid nucleic dùng trong chẩn đoán N. gonorrhoeae

cần phải đ−ợc cân nhắc về mặt giá cả tr−ớc khi áp dụng vì nó th−ờng có chi phí đắt hơn so với ph−ơng pháp nuôi cấy, phân lập truyền thống. Để giảm chi phí, một số phòng xét nghiệm đã trộn các bệnh phẩm với nhau. Nhìn chung, ảnh h−ởng của việc trộn các bệnh phẩm với nhau cũng ch−a rõ, mặc dù có ít nhất hai nghiên cứu đã cho thấy một số −u điểm của ph−ơng pháp này. Kacena và cộng sự việc sử dụng phản ứng liên kết chuỗi trong xác định

N. gonorrhoeae có thể giảm chi phí tới 60% với độ nhạy là 95,8% so với việc không trộn bệnh phẩm. Các nhận xét t−ơng tự của Kissin và cộng sự cũng cho thấy điều này. Tuy nhiên, trộn các bệnh phẩm cũng có thể làm giảm độ nhạy của kỹ thuật khuếch đại acid nucleic. Độ nhạy của kỹ thuật sẽ giảm tỷ lệ với số bệnh phẩm đ−ợc trộn. Ví dụ, cứ trộn 10 bệnh phẩm sẽ làm giảm giới hạn phát hiện đi 10 lần. Tỷ lệ các chất ức chế cũng là một vấn đề phải quan tâm. Rất có thể, việc trộn các bệnh phẩm có tỷ lệ các chất ức chế cao sẽ làm tỷ lệ các chất này cao lên trong hỗn hợp. Chính vì vậy, việc kiểm tra các bệnh phẩm riêng lẻ là rất cần thiết. Tỷ lệ bệnh phẩm d−ơng tính cũng rất quan trọng. Ng−ời ta có thể nói rằng, việc trộn bệnh phẩm chỉ nên tiến hành với các quần thể nghiên cứu có tỷ lệ mới mắc thấp. Đó là bởi vì các lợi ích của việc trộn bệnh phẩm bắt nguồn từ việc khả năng xác định đồng thời các kết quả âm tính cho tất cả các bệnh phẩm trong hỗn hợp. Nếu hỗn hợp cho kết quả D−ơng tính, thì toàn bộ các bệnh phẩm sẽ phải kiểm tra lại. Do

bệnh phẩm. Thêm vào đó, mặc dù việc trộn các bệnh phẩm trong việc phát hiện vi khuẩn lậu có thể tiết kiệm sinh phẩm nhung nó cũng có thể làm mất thời gian trong việc trộn bệnh phẩm và phân tích kết quả [44].

- Tính phức tạp của kỹ thuật và việc kiểm tra chất l−ợng

Một hạn chế nữa của các kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định N. gonorrhoeae là chúng phức tạp hơn các kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông th−ờng. Các kỹ thuật sinh học phân tử th−ờng bao gồm 3 b−ớc đặc thù: Tách chiết acid nucleic, khuếch đại và phát hiện chúng. Mỗi một b−ớc trên đều có thể có những sai sót bao gồm các sai sót do con ng−ời, do sinh phẩm và sự nhiễm từ ngoài. Nh− vậy, biện pháp nội kiểm có hiệu quả và việc quản lý chất l−ợng xét nghiệm thực sự rất cần thiết. Nhìn chung, nó bao gồm việc đảm bảo các sinh phẩm có nguồn gốc, chất l−ợng tốt, tay nghề thành thạo của ng−ời tiến hành xét nghiệm. Tất cả những vấn đề này cũng có thể làm tăng giá thành của các xét nghiệm ứng dụng kỹ thuật này. Việc quản lý chất l−ợng xét nghiệm có liên quan đặc biệt đến các kỹ thuật tự phát triển. Với các kỹ thuật này, điều quan trọng là phải đ−ợc đánh giá bằng các bộ test chuẩn, nhất là khi áp dụng các kỹ thuật tự phát triển nhằm xác định N. gonorrhoeae tại những quần thể mới [44].

- Vấn đề tính nhạy cảm với kháng sinh của N. gonorrhoae

Một hạn chế đáng kể của các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào sự khuếch đại nucleic acid của N. gonorrhoeae là chúng không có khả năng cung cấp các dữ liệu về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn này. Điều này đặc biệt quan trọng khi mà vấn đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đang nổi cộm. Các kỹ thuật sinh học phân tử có thuận lợi là khuếch đại một hoặc một số đoạn gien đặc hiệu của N. gonorrhoeae nên mặc dù vi khuẩn không sống nh−ng có mặt trong bệnh phẩm, thì vẫn cho kết quả d−ơng tính. Tuy nhiên, việc phát hiện sự có mặt của N. gonorrhoeae trong bệnh phẩm không đồng

nghĩa với việc có đ−ợc thông tin về tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Muốn làm đ−ợc điều này, ng−ời ta phải làm kháng sinh đồ và cẩn phải có chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc và thuần nhất.

Nhiều thiết kế dựa trên kỹ thuật khuếch đại acid nucleic của N. gonorrhoeae

đã đ−ợc áp dụng nh− vịêc khuếch đại các protein màng ngoài, 16S rRNA, gen cppB-một gien nằm trên plasmid nh−ng có khả năng tích hợp trên nhiễm săc thể ...

Xác định các đặc điểm liên quan đến cấu trúc di truyền của N. gonorrhoeae

có vai trò quan trọng vì nó khách quan, tin cậy, rõ ràng, có độ lặp lại cao và là một ph−ơng tiện hữu dụng trên lâm sàng và dịch tễ học đối với nhiễm trùng do vi khuẩn này. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đ−ợc phát triển có vai trò quan trọng góp phần làm tăng hiểu biết của chúng ta về các quần thể vi khuẩn trong bối cảnh của sự thay đổi về địa lý, các nhóm nguy cơ khác nhau, sự lan truyền cũng hiệu quả điều trị trên lâm sàng. Gần đây, ng−ời ta thấy rằng, kỹ thuật có độ chính xác khá cao, tin cậy đối với việc đánh giá dịch tễ học phân tử của N. gonorrhoeae có lẽ là dựa trên cơ sở giải trình tự của một hoặc hai gien có sự thay đổi khá nhiều nh− porB, và tbpB [14, 44].