a. Tổng quan
Trong thuật ngữ di truyền học, xỏc định trỡnh tự DNA là quỏ trỡnh xỏc định trật tự nucleotide của một đoạn DNA. Hiện nay, hầu hết mọi xỏc định trỡnh tự DNA đều được thực thi dựng phương phỏp phõn tỏch trỡnh tự (chain termination method) được phỏt triển bởi Frederick Sanger. Kĩ thuật này dựng phõn tỏch trỡnh tự cụ thể (sequence-specific termination) của một phản
ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dựng nucleotide đó được chỉnh sửa.
b. Tại sao phải xỏc định trỡnh tự DNA
Trỡnh tự của DNA mó húa cỏc thụng tin cần thiết để cho cỏc cơ thể sống cú thể tồn tại và tỏi sản sinh. Việc xỏc định trỡnh tự vỡ thế rất hữu ớch với cỏc nghiờn cứu 'thuần tỳy' để lớ giải tại sao và bằng cỏch nào mà cỏc cơ thể tồn tại, cũng như cỏc chủ đề mang tớnh ứng dụng. Vỡ bản chất quan trọng của DNA đối với cỏc sinh vật sống, hiểu biết về trỡnh tự DNA cú thể trở nờn hữu ớch với cỏc nghiờn cứu sinh học và ứng dụng. Vớ dụ, trong y khoa nú cú thể được dựng để xỏc định, chẩn đoỏn và phỏt triển cỏc phương phỏp điều trị cho
c. Ph−ơng pháp
Hai ph−ơng pháp xác định trình tự chính là ph−ơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và ph−ơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhau về nguyên tắc, hai ph−ơng pháp này có một số điểm chung: Hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau, mỗi oligonucleotide có xác xuất xuấ hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó đ−ợc phân tách dựa vào kích th−ớc bằng điền di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide. Kết quả đ−ợc đọc trên bảng phóng xạ tự ghi hoặc nhờ máy đọc tự động.
a. Ph−ơng pháp hóa học
Tr−ớc hết, các phân tử ADN đ−ợc đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó, chúng đ−ợc chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý hóa học riêng biệt có khả năng làm biến đổi đặc tr−ng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử ADN ngay tại nucleotide ấy. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết quả cua các xử lý hóa học là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp có kích th−ớc khác nhau nh−ng đều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng, năm phân đoạn trên đ−ợc đem phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí các oligonucleotide trên gel t−ơng ứng với kích th−ớc của chúng và đ−ợc
phát hiện nhờ đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả đ−ợc đọc trên bản phóng xạ tự ghi.
b. Ph−ơng pháp enzyme học (thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger)
Ph−ơng pháp này dựa vào sự tổng hợp ADN nhờ enzyme ADN polymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc tr−ng của ph−ơg pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông th−ờng còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong đó nhóm 3’OH đ−ợc thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester và do đó, sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả của phản ứng là tạo ra các đoạn ADN có kích th−ớc khác nhau. Sản phẩm đ−ợc đem phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả đ−ợc đọc trên bản phóng xạ tự ghi.