sinh khối rễ của cây Ngũ gia bì chân chim
Sinh khối của rễđối chứng và 3 chủng rễ tơ được thu, sấy khô, nghiền nhỏ và tiến hành chiết bằng cồn. Dịch chiết thu được tiến hành đánh giá sơ bộ nhóm loại và hàm lượng tổng số saponin.
Tiến hành phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin Triterperoid của sinh khối rễ của cả rễ tơ và rễđối chứng (mô tả trong phương pháp) cho
thấy: Cả 3 lần thí nghiệm lặp lại cho mỗi chủng đều thấy ống nghiệm thứ hai chứa NaOH có cột bọt cao và bền hơn ống nghiệm thứ nhất chứa HCl. Như vậy có thể khẳng định được rằng rễ Ngũ gia bì chân chim chứa hợp chất Saponin steroid.
Hình 32: Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin Triterperoid của sinh khối rễ của cả rễ tơ và rễ đối chứng
Sinh khối của cả 3 chủng rễ tơ và đối chứng cảm ứng in vitro nuôi trên môi trường B5 lỏng lắc được thu và tiến hành đánh giá hàm lượng saponin tổng số, kết quả thu được thể hiện trong bảng 37.
Bảng 38. Đánh giá hàm lượng saponin tổng số trên nguồn rễ chuyển gen cây Ngũ gia bì chân chim
Chủng rễ Chỉ số bọt Đối chứng (rễ cảm ứng in vitro) 134,60 ± 3,82 11325 141,81 ± 8,01 15834 136,61 ± 7,25 TR7 144,89 ± 11,75 Kết quả trong bảng cho thấy ở cả 3 dòng rễ tơ và đối chứng đều có mặt của hợp chất saponin. Các dòng rễ tơ có giá trị lần lượt chủng 11325 đạt 141,81 ± 8,01, chủng 15834 đạt 136,61 ± 7,25, và chủng TR7 đạt 144,89 ± 11,75. Như vậy có thể thấy rằng hàm lượng tổng số ở 3 chủng là gần như tương đương nhau có sai khác nhưng không nhiều. Đây là cơ sở cho các thí nghiệm sau này đểđiều chỉnh sự tích lũy saponin trong sinh khối rễ.
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã thu thập, đánh giá và lưu giữ được 02 nguồn gen cây Ngũ gia bì chân chim và 02 nguồn gen cây Tam thất phục vụ cho nghiên cứu
2. Tạo được vật liệu sạch in vitro phục vụ cho chuyển gen trên hai đối tượng nghiên cứu.
3. Sử dụng các chủng Agrobacterium rhizogenes TR7 để chuyển gen trên Tam Thất đã đưa lại hiệu quả bước đầu trong việc cảm ứng hình thành rễ tơở mật độ OD600 = 0,2-0,3, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễđạt 35%. Kết quả cảm ứng được 05 dòng rễ sau chuyển gen.
4. Trên cây Ngũ gia bì chân chim, cả 3 chủng Agrobacterium rhizogenes nghiên cứu đều có khả năng cảm ứng hình thành rễ tơ. Mật độ dịch lây nhiễm thích hợp cho lây nhiễm đối với chủng vi khuẩn TR7 và chủng 11325 là OD600= 0,4. Chủng vi khuẩn 15834 có khả năng tạo rễ tơ tốt nhất và mật độ dịch lây nhiễm thích hợp là dịch huyền phù vi khuẩn có OD600= 0,5. Kết quả cảm ứng được 61 dòng rễ sau chuyển gen của cây Ngũ gia bì chân chim (23 dòng rễ chủng 15834, 25 dòng rễ chủng 11325, 13 dòng rễ chủng TR7).
5. Đã lựa chọn được 04 dòng rễ tơ Tam thất, 09 dòng rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim dựa trên phương pháp PCR và đánh giá được sự sinh trưởng của các dòng rễ này.
6. Môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim là môi trường B5 lỏng +30 g/l Sucrose, lắc 100 vòng/phút.
7. Bổ sung GA3 với nồng độ 3 mg/l vaog môi trường nuôi cấy làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ mẫu phân nhánh của rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim. Ngược lại α-NAA và IAA lại không thích hợp cho sự tăng sinh khối rễ.
8. Bổ sung 200 mg/l yeast extract hoặc 300 mg/l pepton, 200 mg/l adenine sulphate hoặc 300 mg/l phenylalanine vào môi trường nuôi cấy làm tăng tốc độ sinh trưởng của rễ tơ nuôi cấy.
9. Bổ sung Jasmonic acid vào môi trường nuôi cấy không làm tăng sinh khối nhưng lại làm tăng sự tích lũy saponin tổng số ở rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim.
10. Điều kiện nuôi cấy tối hoàn toàn thích hợp cho việc nhân nhanh sinh khối rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim.
11. Thử nghiệm nuôi cấy rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim trên hệ thống bioreactor ngập chìm gián đoạn tỏ ra thích hợp cho việc tăng sinh khối rễ.
12. Các dòng rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim có hàm lượng saponin tổng số tương đương nhau .
Kiến nghị
Dựa trên những kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi có đề nghị như sau:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là bước đệm, bước thăm dò ban đầu quan trọng để đề xuất các nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp cao hơn. Các dòng rễ tơđặc trưng của cây Ngũ gia bì chân chim có thểđược dùng đểứng dụng sản xuất saponin trong điều kiện in vitro.
PHẦN IV: DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. 29-32. [2] Ngô Thị Tú Trinh (2011). Luận văn tốt nghiệp: Nghiên cứu phôi vô
tính và thử nghiệm chuyển GEN tạo rễ tóc thông qua vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes ở cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa L. Harms)
(NLN-NN01), Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh.
[3] Nguyễn Thị Hạ Hương (2011). Đồ án chuyên ngành: Thu nhận
Ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Panax Ginseng
C.A Meyer, Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh-Trường đại học Bách khoa- Khoa kỹ thuật hóa học-Bộ môn Công nghệ sinh học.
[4] Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011). Nghiên
cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis, Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 27: 30-36.
[5] Nguyễn Trung Thành và Paek Kee Yoeup (2008). Nhân nhanh rễ
bất định Nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer: những chất cảm ứng tăng sinh trưởng và tăng sinh khối sản phẩm trao đổi chất ginsenosides. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 24: 318-323.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[6] Adelberg, J. (2008). Agitated, Thin-Film of Liquid Media for
Efficient Micropopagation. In: Plant Tissue Culture Engineering. Eds.
Gupta, S.D and Ibaraki, Y. Springer, Netherland.
[7] Akramian, Morteza, Seyed Mohammad, Fakhr Tabatabaei and Masoud Mirmasoumi (2008). Virulence of Different Strains of
Agrobacterium rhizogenes on Genetic Transformation of Four Hyoscyamus Species. American-Eurasian J. Agric. & Environ. 3: 709-763.
[8] Arif Yachya (2009). Effect of Aeration Rate and Inoculum
Density on Biomass and Saponin Content in Balloon-Type Bubble Bioreactor Culture of Java Ginseng (Talinum paniculatum Gaertn.) Hairy Roots.
[9] Arya, Sarita, Inder Dev Arya and Tage Eriksson (1993). Rapid
multiplication of advetious somatic embryos of Panax ginseng. Plant Cell Rep 34: 7-10.
[10] Bais, H.P., Sudha, G., George, J., and G.A. Ravishankah (2001).
Influence of exogenous hormones on growth in secondary metabolite production in hairy root cultures of Chicorium intybus L. cv. lucknow local. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 37: 293-299.
[11] Begoniasing, Mary and Charlotte Toulouse (2001). Phitochemical
variation immunopharmacology of Panax Quinquefolius L.: 1-191.
[12] Bourgaud, F. Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. (2001). Production
of plant secondary metabolites: A historical perspective. Plant Sci. 161:
839-851.
[13] Choi, KT, IO Ahn and JC Park (1994). Production of ginseng
saponin in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer).
Russian Journal of Plant Physiology 41: 784-788.
[14] Choi, Kwang-Tae and Gyuhwa Chung (2001). Genetic Resources,
Chromosome Engineering, and Crop Improvement. Medicinal Plants 6:
513-538.
[15] Christensen, B., S. Sriskandarajah and R. Müller (2009).
Transformation of Hibiscus rosa-sinensis L. by Agrobacterium rhizogenes. J. Hort. Sci. Biotech. 84: 204–208.
[16] Curtis, W.R. (2005). Application of Bioreactor Design Principles
to Plant Micropopagation. In: Liquid Culture System for in vitro Plant Propagation. Eds. Eide- Hvoslef, K.A and Preil, W. Springer, Netherland.
[17] Damiano, Carmine and Simona Monticelli (1998). In vitro fruit trees rooting by Agrobacterium rhizogenes wild type infection. EJB
Electronic Journal of Biotechnology 1: 0717-345.
[18] Dolinski, R. (2004). Indukcja kalusa in regeneracja roślin żeń- szenia amerykańskiego (Panax quinquefolius L). Ann. UMCS 51: 1131-
1138.
[19] Ford, YY, RG Ratcliffe and RJ Robins (1996). Phytohormone-
induced GABA production in transformed root cultures of Datura stramonium: an in vivo 15N NMR study. African Journal of Biotechnology
11: 7020-7027.
[20] Forst, J. R. and G. Forst (2005). Schefflera heptaphylla
(Linnaeus) Frodin.
[21] Furuya, T., T. Yoshikawa, T. lshii and K. Kajii (1983). Effects of
auxins on growth and saponin production in callus cultures of Panax ginseng. Plant Research metlica 47: 183-187.
[22] Furuya, T, H Kojima, K Syono, T shii and K Uotani (1973).
Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng.
Chem Pharm Bull 21: 98-101.
[23] Gorpen, T. Y., K. V. Ki, V. P. Bul, G. K. Tchern, E. A. Bragina, M. V. Khodako, O.G. Koren, T. B. Batygina and Yu. N. Zhur (2006). The
Agrobacterium rhizogenes rolC-gene-induced somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed calluses. Planta 223:
[24] Haberlandt, G. (1902). Kulturversuche mit isolierten
Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-Naturwiss. Kl., Abt.
J. 111: 69–92.
[25] Hu, Zhi-Bi and Min Du (2006). Hairy Root and Its Application in
Plant Genetic Engineering. Journal of Integrative Plant Biology 48: 1211-
127.
[26] Hui-Lin Li (1942). The Araliaceae of China.
[27] Jeong, Gwi-Taek, Don-Hee Park, Hwa-Won Ryu, Baik Hwang, Je- Chang Woo, Doman Kim and Si-Wonk Kim (2005). Production of
antioxidant compounds by culture of Panax ginseng C.A. Meyer hairy roots. Applied Biochemistry And Biotechnology 121: 1147-1157.
[28] Kim, Jung Hea, Eun Jung Chang and Hoon-Il Oh (2005). Saponin
Production in Submerged Adventitious Root Culture of Panax ginseng as Affected by Culture Conditions and Elicitors. AsPac J. Mol. Biol.
Biotechnol 13: 1789-1792.
[29] Kim, Yun-Soo, Jung-Yeon Han, Soon Lim and Yong-Eui Choi (2009). Ginseng metabolic engineering: Regulation of genes related to ginsenoside biosynthesis. Biomedical and life sciences. 92: 1270-1276.
[30] Krewzaler F and Hahlbrock K. (1973). Flavonoid glycosides from
illuminated cell suspension cultures of Petroselinum hortense. Phytochem. 12: 1149-1152.
[31] Kumar, Vinod, Ashwani Sharma, Bellur Chayapathy Narasimha Prasad, Harishchandra Bhaskar Gururaj and Gokare Aswathanarayana Ravishankar (2006). Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment. Electronic Journal of
[32] Liu, CZ, Wang, YC, Ouyang, F, Ye, HC, and Li, GF. (1997).
Production of artemisinin by hairy root culture of Artemisia annua L.
Biotechnol. Lett. 19: 927-929.
[33] Liu CZ, Guo C, Wang YC, Ouynag F. (2002). Effect of light
irradiation on hairy root growth and artemisinin biosynthesis of
Artemisia annua L. Biochem J. 38: 581-585.
[34] Lu, M., H. Wong and W. Teng (2008). Effects of elicitation on the
production of saponin in cell culture of Panax ginseng. Plant cell reports 20: 647-677.
[35] Luczkiewicz M, Zarate R, Migas WD, Migas P, Verpoorte R. (2002). Production of pulchelin E in hairy roots, callus and suspension cultures of Rudbeckia hirta L. Plant Sci. 163: 91-100.
[36] Mukundan U and Hjortso M A (1991). Growth and thiophene
accumulation by hairy root cultures of Tagetes patula in media of varying initial pH. Plant Cell Reports. 9 : 627-630.
[37] Mulbagal V, Tsay HS (2004). Plant cell cultures-an alternative
and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science and
Engineering 2(1): 29-48.
[38] Nah, S.Y., (1997). Ginseng: Recent advances and trends. Korean J. Ginseng Sci. 21: 1–12.
[39] Nam, Park, Xiaohua Li, MD Uddin Romij and Park Sang Un (2011). Phenolic compound production by different morphological phenotypes in hairy cultures of Fagopyrum tataricum Gaertn. Archives of
Biological Sciences 63: 139-198.
[40] Nhut, Duong Tan, Nguyen Phuc Huy, Hoang Xuan Chien, Tran Cong Luan, Bui The Vinh and Lam Bich Thao (2011). Effects of
from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et. Grushv.). African Journal of Biotechnology 11: 19499-
19504.
[41] Nhut, Duong Tan, Nguyen Phuc Huy, Hoang Xuan Chien, Tran Cong Luan, Bui The Vinh and Lam Bich Thao (2012). In vitro culture of petiole longitudinal thin layer explants of Vietnamese ginseng (Panax Vietnamensis Ha et grushv.) and preliminary analysis of saponin content.
Internationl journal of applied biology and pharmaceutical technology 3: 4- 12.
[42] Pamela, J, Weathers, G. Bunk and M. C. McCoy (2005). The Effect
of Pytohormones on Growth and Artemisinin Production in Artemisia annua Hairy Root. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 41:
47-53.
[43] Park, Sang – Un and J.Facchini Peter (2000). Agrobacterium rhizogenes – mediated transformation of opium poppy, papaver somniferum L., and Califonia poppy, Eschicholzia californica Cham.,root cultures. Journal of Experimental Botany 51: 1065-1017.
[44] Petit, A, C David, GA Dahl, JG Ellis, P Guyon, F Casse-Delbart and J Tempé. (19830. Further extension of the opine concept: plasmids in
Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.
Phytochemistry reviews 1: 3-25.
[45] Robins RJ, Bent EG, Rhodes MJC (1991). Studies on the
biosynthesis of tropane alkaloids by Datura stramonium L. transformed root cultures. The relationshi between morphological integrity and alkaloid biosynthesis. Planta185: 385-390.
[46] Samuel, G. Obae, Klandorf Hillar and P. West Todd (2011).
Growth Characteristics and Ginsenosides Production of In Vitro Tissues of American Ginseng, Panax quinquefolius L. Hortscience 46:128-134.
[47] Satdive RK, Fulzele DP, Eapen S. (2007). Enhanced production of
azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss by elicitation and media optimization. J Biotechnol 128: 281-289.
[48] Sathiyamoorthy, Subramaniyam, Jun-Gyo In, Byum-Soo Lee, Woo- Seang Kwon, Dong-Uk Yang, Ju-Han Kim and Deok-Chun Yang (2011).
Insilico Analysis for Expressed Sequence Tags from Embryogenic Callus and Flower Buds of Panax ginseng C. A. Meyer. Research Article J.
Ginseng Res 35: 21-30.
[49] Sauerwein, M.; Ishimaru, K.; Shimomura, K. (1991). A piperidone alkaloid from Hyoscyamus albus roots transformed with Agrobacterium
rhizogenes. Phytochemistry vol. 30 issue 9: 2977-2978.
[50] Sivakumar, G, KW Yu, Ỵ Hahn and KY Paek (2005).
Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large- scale bioreactors. Current Sci 89: 641-649.
[51] Shibata, S., O. Tanaka, J. Shoji, and H. Saito. (1985). Chemistry
and pharmacology of Panax. In: H. Wagner, H. Hikino, and N.R. Farnsworth. Econ. Medicinal Plant Res. vol. 1: 218– 284.
[52] Shu, W, K Yoshimatsu, H Yamaguchi and K Shimomura (1999).
High production of ginsenosides by transformed root cultures of Panax ginseng: effect of basal medium and Agrobacterium rhizogenes strains.
Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku:117: 1484-1454. [53] Smith, R. G.; Caswell, D.; Carriere, A.; Zielke, B. (1996).
Variation in the ginsenoside content of American ginseng, Panax quinquefolius L., roots. Can. J. Bot. 74: 1616-1620.
[54] Soldati F, Tanaka 0. (1984). Panax ginseng: relation between age of plant and content of ginsenosides. Planta Medica 50: 351-352.
[55] Stafford A., Morris P., Fowler M.W., (1986). Plant cell
[56] Tiwari, RK, M Trivedi, ZC Guang, GQ Guo and GC Zheng (2007).
Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures. Plant Cell Rep 26: 199-
210.
[57] Tomilov, A, N Tomilova and JI Yoder (2007). Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes transformed roots of the parasitic plant Triphysaria versicolor retain parasitic competence. Planta
225: 1059-1071.
[58] Vanhala, L., Eeva, M., Lapinjoki, S., Hiltunen, R., and K. Oksman- Caldentey (1998). Effect of growth regulators on transformed root
cultures of Hyoscyamus muticus. J. Plant Physiol. 153.
[59] Wang, Andrew S. (1990). Callus Induction and Plant
Regeneration of American Ginseng. Hortscience 25: 571-572.
[60] Wang, J H. (2008). Studies On Optimization Of Culture
Condition And Second Metabolism Regulation Of Panax Ginseng. Agricultural Sciences 15: 3-8.
[61] Wu, Jianyong and Jian-Jiang Zhong (1999). Production of ginseng
and its bioactive components in plant cell culture: Current technological and applied aspects. Journal of Biotechnology 68: 89-99.
[62] Xu, Hongwei, Xiaofu Zhou, Jingmei Lu, Junjie Wang and Xingzhi Wang (2006). Hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes and production of regenerative plants in hairy root cultures in maize. Science
in China Series C: Life Sciences 49: 305-310.
[63] Yang, D-C and Y-E Choi (2000). Production of transgenic plant
via Agrobacterium rizogens – mediated transformation of Panax ginseng.
[64] Yu, Kee-Won, Hosakatte Niranjana Murthy, Eun-Joo Hahn and Kee-Yoeup Paek (2005). Ginsenoside production by hairy root cultures of
Panax ginseng: influence of temperature and light quality. 53–56.
[65] Yu, K.W., E.J. Hahn and K.Y. Paek (2003). Gingsenoside
production by hairy cultures of Panax ginseng C.A. Meyer in bioreactor.
ISHS Acta Horticulturae 597: International Conference on Medicinal and Aromatic Plants (Part II) 499-103.
[66] Yu, Kee-Won, Wen-Yuan Gao, Sung-Ho Som and Kee-Yoeup Paek (2000). Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitors in hairy root culture of ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer); In vitro cellular & developmental biology. PLANT 36: 1054-5476.
[67] Yu, SH, JP Zha, WH Zhan and DQ Zhang (2006). Contents
comparison of resveratrol and polydatin in the wild Polygonum cuspidatumplant and its tissue cultures. 31: 424-428.
[68] Yun-Soo, Kim, Edward C., Yeung Eun-Joo, Hahn Kee-Yoeup and Paek (2007). Combibed effects of phytohormone, indole-3-butyric cid,
and methyl jamonate on root growth aand ginsenoside production in adrentitoous root cultures of Panax ginseng C A.Meyear. Biotechnol life
29: 10-13.
[69] Zhong JJ, Seki T, Kinoshita S, Yoshida T. (1991). Effect of light
irradiation on anthocyanin production by suspended cultures of Perilla frutescens. Biotechnol Bioeng 38: 653-658.
[70] Zhou, Qian-yun, Jian-min ZHou, Jun Liu, Shu-pan Zhang and Jia-yi Dinh (2003). Influence of elicitors on ginsenoside content in Panax ginseng hairy roots. Journal of Nanjing Military Medical College 3: 15-20.
[71] Zhou, Xiaofu, Yuxia Wu, Xingzhi Wang, Bao Liu and Hongwei Xu (2006). Salidroside Production by Hairy Roots of Rhodiola sachalinensis
Obtained after Transformation with Agrobacterium rhizogenes. Plant Sci.
24: 439-442.
[72] Zupan, J and P Zambryski (1997). The Agrobacterium DNA
transfert complex. Crit Rev Plant Sci 16: 279-295. TÀI LIỆU INTERNET
[74] http://www.camnangsuckhoe.vn [75] http://www.caythuocquy.info.vn [76] http//www.caythuocvn.com [77] http://www.duoclieu.org.vn [78] http://www.panda.org/greatermekong [79] http://www.rescancer.com/stomach-cancer/9609.html [80] http://www.tudienthuoc.net
PHẦN V: PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC NGHIÊN CỨU
Thành phần môi trường MS, B5 Thành phần MS (mg/L) B5 (mg/L) Đa lượng NH4NO3 1650 (NH4)2SO4 134 NH4H2PO4 KNO3 1900 2500 Ca(NO3)2.4H2O K2SO4 CaCl2.2H2O 440 150 MgSO4.7H2O 370 250 KH2PO4 170 NaH2PO4 150 KCl Vi lượng MnSO4.4H2O 23,3 10 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O 8,6 2 H3BO3 6,2 3 KI 0,83 0,75 Na2MoO2.2H2O 0,25 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 Na2EDTA 37,3
FeSO4. 7H2O 27,8 SodiumFerric EDTA
Vitamin và axit amin
Thiamine HCl 0,1 10 Nicotinic axit 0,5 1 Pyridoxine HCl 0,5 1 Glycine 2 Lysine L-Cystein Folic axit Biotin Myo-inositol 100 100 Đường Sucrose (g/l) 30 20
PHỤ LỤC 2: QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ MẪU TAM THẤT VÀ NGŨ GIA BÌ CHUYỂN GEN
2.1 Qui trình tách chiết DNA tổng số mẫu Tam thất chuyển gen (Vaghese và cs 1997, cải tiến)
• Hóa chất:
+ Hea buffer (2%CTAB, 20Mm EDTA, 100Mm Tris-HCl, 1.4M NaCl) + Cloroform/Isoamylalchohol 24:1
+ phenol: clorophom: isopropanol 25:24:1 + 2-propanol
+ 70% ethanol + 1×TE
• Quy trình:
- Bước 1: Lấy 50mg mô lá nghiền trong nito lỏng, sau đó bổ sung 700µl Hea buffer trên đá. Ủở 65oC trong 30 phút, sau đó để nguội.
- Bước 2: Bổ sung 700µl phenol: clorophom: isopropanol 25:24:1, lắc nhẹ nhàng, li tâm 13000rpm, 15 phút, sau đó hút lấy dịnh trong chuyển sang ống