- Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành.
- Các phương pháp nghiên cứu được tiến hành trong đề tài đều là phương pháp quy chuẩn hiện hành.
- Phương pháp bố trí thí nghiệm, phương pháp thống kê đánh giá các chỉ tiêu sinh học theo phương pháp hiện hành.
- Xử lý số liệu theo theo chương trình IRRISTART 5.0 và MS Excel.
x 100%
Tổng số mẫu sạch chết x 100%
Tổng số mẫu nuôi cấy Tổng số mẫu tạo rễ Tổng số mẫu tạo
CHƯƠNG II: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1 Chuẩn bị nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu
2.1.1 Thu thập, lưu giữ nguồn gen/vật liệu hai loài dược liệu Tam thất, Ngũ gia bì chân chim từ các địa phương trong nước
2.1.1.1 Thu thập nguồn gen cây Ngũ Gia bì chân chim
¾ Cây Ngũ Gia B́ì Chân Chim thường
Cây Ngũ Gia bì chân chim được thu thập 3 đợt (9 cây) từ trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (Trâu Quỳ- Gia Lâm- Hà Nội). Hiện nay, Cây Ngũ Gia Bì thường được lưu giữ ở dạng chồi và cây in vitro trong phòng thí nghiệm, dạng lá tươi, dạng mẫu lá đã sùi callus trên các môi trường có chứa chất điều tiết sinh trưởng khác nhau và cây trồng trong nhà lưới Khoa Công nghệ Sinh học – Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Đặc điểm thực vật học:
Cây sử dụng làm nguồn vật liệu chuyển gen có độ tuổi khoảng 3-4 năm. Thân cây có chiều cao trung b́ình khoảng 2-8m, luôn xanh. Các lá có hình chân vịt có khoảng 8 lá chét, hình trứng thuôn dài. cuống lá dài 8-35 cm, chiều dài lá khoảng 7-20 cm, chiều rộng lá 3-6cm, toàn bộ mép lá chét nguyên vẹn, nhẵn nhụi, cuống lá không đồng đều. Cụm hoa chùm tán, hoa nhỏ màu trắng, số cánh hoa và nhị bằng nhau thường là 5. Bao phấn 2 ô, bầu hạ 5-6 ô. Quả hình cầu, đường kính 3-4mm, khi chín có màu tím sẫm đen, có khoảng 6-8 hạt. Đặc điểm của cây Ngũ Gia Bì Chân Chim thường rất dễ sinh trưởng, tốc độ phát triển nhanh.
¾ Cây Ngũ Gia Bì SaPa
Cây được lưu giữ trong vườn thực vật khoa Nông Học - trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. So với Ngũ Gia Bì thường thì Ngũ Gia Bì Sapa không có nhiều đặc điểm khác, đặc trưng của cây là lá có 6 lá chét, có chiều dài lá
khoảng 10-20cm, chiều rộng lá 8-10cm. Mép lá nguyên vẹn, cuống lá không đồng đều. Tốc độ sinh trưởng của cây nhanh và rất dễ phát triển.
So sánh, đối chiếu đặc điểm thực vật học của nguồn gen thu thập được và mô tả trong các dữ liệu chuyên ngành thì hai nguồn gen này được xác đinh tên loài là:
Loài thu thập tại Gia Lâm – Hà Nội: Schefflera octaphylla Loài thu thập tại Sa Pa – Lào Cai: Schefflera heptaphylla
¾ Lưu giữ nguồn gen cây Ngũ Gia bì chân chim trong điều kiện in vitro
Bên cạnh việc lưu giữ nguồn gen cây Ngũ gia bì chân chim trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm, chúng tôi đồng thời tiến hành lưu giữ ở dạng cây con in vitro. Nguồn vật liệu in vitro được bắt đầu với việc vào mẫu các đoạn thân chứa mắt ngủ, sau thời gian nuôi cấy 6 tuần, cây con invitro tiếp tục được chuyển sang môi trường nhân chồi.
1 2 3
Hình 1: Hình ảnh Ngũ Gia Bì Chân Chim (1: Ngũ Gia Bì thu thập tại Hà
Nội; 2: Ngũ Gia Bì thu thập tại Sa Pa; 3: Ngũ Gia Bì lưu giữ trong điều kiện in vitro)
2.1.1.2 Thu thập nguồn gen cây Tam thất
Trong nghiên cứu của chúng tôi, nguồn gen cây Tam thất được thu thập tại 2 tỉnh là Hà Giang và Lào Cai. Vật liệu nghiên cứu thu thập được rất đa dạng: cây, thân lá, hoa, quả và rễ củ (với nhiều kích thước khác nhau).
¾ Phân tích về hình thái các mẫu Tam Thất thu thập được
Đặc điểm lá: Mẫu tam thất ở Sa Pa có dạng lá kép chân vịt mọc vòng ba cái một, mang bẩy lá chét mỏng, không có lông ở trên mặt lá, gân lá đối nhau, mép lá có răng đôi cạn hay sâu dạng thùy. Còn lá tam thất ở Hà Giang có dạng lá kép chân vịt mọc vòng ba cái một, mang bẩy lá chét, có lông cứng ở gân trên cả hai mặt lá, gân lá mọc đối, mép lá khía răng có hình mũi mác không có dạng thùy.
Đặc điểm rễ củ: Cây có một rễ chính phình thành củ và có những rễ phụ. Trên mặt củ có nhiều vết sẹo do thân củ để lại sau mỗi mùa đông. Mặt ngoài củ màu vàng xám nhạt, trên mặt có những nét nhăn nhỏ theo chiều dọc.Ở mẫu tam thất ở Hà Giang củ ít đốt, có hình dạng giống củ gừng. Còn mẫu tam thất ở Sa Pa củ có nhiều đốt nhưđốt tre, củ dài.
Mẫu củ và lá của tam thất ở Sa Pa và Hà Giang có sự khác nhau về mặt hình thái học khá rõ rệt. Dựa vào mặt hình thái, chưa thể kết luận chúng là hai loài tam thất có sự khác nhau về mặt hình thái và mặt di truyền, hoặc hai mẫu tam thất này là một loài khác nhau về mặt hình thái do khoảng cách về địa lý, điều kiện khí hậu ở hai vùng mà về mặt di truyền giống nhau.
Hình 2: Nguồn gen cây Tam Thất thu thập tại Hà Giang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A B C
Hình 3: Nguồn gen cây Tam Thất thu thập tại Sapa (A: Cây Tam Thất ; B:
Củ Tam Thất; C: hạt Tam thất)
¾ Phân tích đặc điểm di truyền các mẫu Tam Thất thu thập được
a. Nhân dòng gene 18S rDNA
Tiến hành chạy PCR nhân dòng gene 18S rDNA ở hai giống tam thất với 3 lần lặp lại: SP(SP1, SP2, SP3) và HG(HG1, HG2, HG3) bằng cặp mồi: 18S-Panax-F và18S-Panax-R cho sản phẩm có kích thước khoảng 1809bp (hình 4.4 a, 4.4 b). Kết quả này phù hợp với kết quả mong muốn. Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1%, đối chiếu kiểm tra kích thước sản phẩm.
Hình 4.4a: Kết quả nhân dòng gene 18S rRNA trên mẫu giống thu thập ở Sa Pa với cặp mồi 18S-F, 18S-R
Hình 4.4b: Kết quả nhân dòng gene 18S rRNA trên mẫu giống thu thập ở Hà Giang với cặp mồi 18S-F, 18S-R
b. Kết quả giải trình tự gene 18S rRNA
Sau khi tinh sạch gen 18S rRNA gửi đi giải trình tự và được so sánh với trình tự 18S rDNA đối chứng trên NCBI (phụ lục). Trình tự gen 18S rRNA của cả hai mẫu giống thu thập ở Hà Giang và Sa Pa có kích thước 1809bp, tương ứng với kích thước của gen 18SrRNA đã được giải trình tự ở các loài
Panax và công bố trên ngân hàng NCBI. các mẫu giống được giả trình tự và có chiều dài gen 18S là 1809bp (chi tiết trong phụ lục 4).
Kết quả BLAST trên ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự 18S rDNA_SaPa trùng 100% với trình tự 18S RNA của loài Panax stipuleanatus (Accession number: AB088025.1 ) và có mức độđồng nhất 97-100% với độ phủ
98-100% so với các trình tự 18S rRNA của các loài ở chi Panax (hình 6). Trình tự 18S-rDNA_HàGiang trùng 100% với trình tự 18S DNA của loài Panax
notoginseng (Accession number: D85171.1 ) , có mức độ đồng nhất là 98-100% với độ phủ 96-100% so với các trình tự 18S rDNA của các loài ở chi Panax (hình 8). Kết quả bước đầu cho thấy, trình tự 18S rDNA của hai mẫu giống thu thập tại SaPa, Hà Giang có mức độ rất cao với các loài thuộc chi Panax.
2.1.2 Nhân nuôi, bảo quản các chủng vi khuẩn Agrobacterium zhizogenes nghiên cứu
¾ Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp và bảo quản các chủng vi
khuẩn Agrobacterium zhizogenes nghiên cứu
Vi khuẩn được lấy ra khỏi tủ lạnh sâu -80oC nuôi trên môi trường LB/AB/YM đặc bằng phương pháp cấy vạch trên đĩa Petri, sau đó nuôi ở tủ ấm 28oC trong 48 - 72h. Sau 72h quan sát so sánh sự phát triển của khuẩn trên đĩa thạch trên các loại môi trường khác nhau. Kết quả về sự phát triển của khuẩn được thể hiện trong Bảng 1.
Bảng 1: Sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium zhizogenes trên các loại môi trường
Loại môi trường Đặc điểm phát triển của khuẩn
LB Khuẩn không mọc hoặc vạch cấy có khuẩn mọc rời rạc, không thu được khuẩn lạc đơn
AB Khuẩn mọc ròi rạc trên đường cấy vạch, không thu được khuẩn lạc đơn.
YM Khuẩn mọc kín trên đường vạch 1, 2. Trên đường vạch 3, 4 thu được khuẩn lạc đơn
Kết quả trên cho thấy răng khuẩn sau khi lấy khuẩn ra khỏi tủ -800C khuẩn được nuôi cấy vạch trên môi trường YM cho kết quả sinh trưởng và phát triển tốt. Kết quả này rất thích hợp cho việc kiểm tra và thu sinh khối trước khi chuyển gen.
Bên cạnh đó, khuẩn sau thời gian lưu giữ trong điều kiện -80oC cũng cho kết quả tốt. Sau thời gian bảo quản, khuẩn nuôi cấy khởi động trên môi trường YM đặc và lỏng khuẩn phát triển tốt như khuẩn ban đầu và không bị nhiễm tạp.
Hình 5 : Vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes nuôi cấy trên môi trường YM đặc thu sinh khối
¾ Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen cảm ứng rễ tơ trong các chủng Agobacterium rhizogenes
Kết quả kểm tra sự có mặt của các gen cảm ứng rễ tơ bằng cặp mồi đặc hiệu cho thấy: chủng TR7 và chủng 11325 chỉ có gen rolA với kích thước mong muốn là 307 bp. Chủng 15834 mang đầy đủ cả 3 gen rol A, B và C với kích thước mong muốn là 307 bp, 762 bp và 504 bp. Chủng TR107, EGFP không thể hiện các vạch của gen rol A và B, C với kích thước mong muốn là 307 bp và 762 bp, 504 bp.
Bảng 2: Kết quả kiểm tra sự có mặt của các gen cảm ứng rễ tơ trong các chủng vi khuẩn Agobacterium rhizogenes nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gen chuyển Chủng vi khuẩn RolA (307bp) Rol B (762bp) Rol C (504bp) TR7 + - - TR107 - - - 15834 + + + 11325 + - -
Hình 6: Kết quả PCR chạy mồi rol A của các chủng Agobacterium rhizogenes nghiên cứu.
Hình 7: Kết quả chạy môig rolC với các chủng Agrobacterium rhizogenes
TR7, EGFP, TR107, 11325, 15834.
Hình 8 : Kết quả chạy PCR kiển tra sự có mặt của gen rol A và rol B trên các chủng TR7, 11325, 15834, EGFP
2.2 Nghiên cứu khảo sát sự cảm ứng hình thành rễ tơ cho 02 loài dược liệu nghiên cứu.
2.2.1 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro cho hai loài cây dược liệu
2.2.1.1 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro cho cây Tam thất
¾ Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng khác nhau bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng mẫu củ Tam Thất
Khử trùng là giai đoạn cần thiết đầu tiên và quan trọng quyết định trực tiếp trong quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu khi nuôi cấy mô. Các chất chất khử trùng khác nhau thường được sử như: NaOCl 5,5% , HgCl2 0,1% và Ca(OCl). Tuy nhiên HgCl2 0,1% là chất thường được sử dụng trong việc khử trùng đạt hiệu quả cao đối với nhiều đối tượng. Bên cạnh đó Cefotaxime cũng là một chất có hiệu quả trong việc diệt khuẩn rất thích hợp để sử dụng khử trùng với các nguồn mẫu tồn tại dưới đất. Chính vì thế đối với mẫu củ Tam Thất việc kết hợp HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đã được sử dụng để khử trùng.
Tất cả các thí nghiệm tiến nuôi cấy trên nền môi trường MS + 1mg/l 2,4D + 30g/l saccarose + 7g/l agar, pH= 5.7. Củ Tam Thất được cắt thành các lát dày 2 mm và được cấy lên các bình môi trường, 1-2 mẫu/ bình. Mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối ở nhiệt độ 22 ± 2oC .
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2
0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính d ≤ 1,5 cm
Tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của chế độ khủ trùng bằng HgCl2
0,1% và cefotaxime với củ Tam thất có đường kính d ≤ 1,5 cmchúng tôi thu được kết quảở Bảng 3.
Bảng 3. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có
đường kính d ≤ 1,5 cm ( sau 8 tuần theo dõi)
Tỷ lệ mẫu có callus CT Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu không cảm ứng (%) Hình thành trên 50% bề mặt mẫu (%) Hình thành dưới 50% bề mặt mẫu (%) CT1 33,53 66,47 10,2 23,33 36,36 63,64 CT2 56,25 43,75 2,3 53,95 29,41 70,59 CT3 11,69 88,31 10,4 1,29 50 50 CT4 28,22 71,78 4,8 23,42 12,5 87,5 CV% 0,7 LSD 0,5 0,66 Ghi chú: - CT1: Khử trùng kép: Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (20 phút ), Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 30 phút,
- CT2: Khử trùng kép: Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (20 phút), Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép : 30 phút + 60 phút, - CT3: Khử trùng kép: Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (30 phút), Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 30 phút, - CT4: Khử trùng kép: Bước 1: Lắc HgCl2 0,1% : lần 1( 20 phút) + lần 2 (30 phút), Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 60 phút.
Qua bảng 3 nhận thấy: Các chế độ khử trùng khác nhau cho hiệu quả khử trùng cũng khác nhau, Đối với mẫu có đường kính d<1,5cm thì CT2 đã cho kết quả khử trùng tốt nhất với tỷ lệ sạch cao nhất đạt 56,25%, Tuy nhiên, hiệu quả khử trùng đạt được cao nhưng tỷ lệ cảm ứng callus lại thấp nhất chỉ đạt 2,3% và callus tạo thành chủ yếu chỉ chiếm dưới 50% bề mặt mẫu, Trong
khi đó, CT3 có tỷ sạch nhiễm thấp nhất chỉ có 11,69% nhưng lại có tỷ lệ cảm ứng callus cao nhất chiếm 10,4% và callus hình thành chủ yếu trên toàn bộ bề mặt mẫu chiếm 50%, Ở CT1 tỷ lệ mẫu sạch cao thứ 2 sau CT2 nhưng khả năng cảm ứng của mẫu thì cao hơn đứng thư 2 sau CT3, Tuy nhiên khả năng cảm ứng của callus trên bề mặt mẫu cũng không cao, Trong khi đó ở CT4 thì hiệu quả khử trùng đạt được cũng không cao, tỷ lệ cảm ứng của mẫu cũng rất thấp, khả năng cảm ứng của callus trên bề mặt mẫu cũng không nhiều.
So sánh CT1 với CT2 và CT3 với VT4 thì khi tăng thời gian khử trùng bằng cefotaxin 800 mg/l lên thì tỷ lệ mẫu sạch cũng tăng lên nhưng khả năng cảm ứng của mẫu cũng giảm đi rất nhiều, Tương tự so sánh CT1 với CT3 và CT2 với CT4 thì khi tăng thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% không làm tăng tỷ lệ sạch của mẫu, Điều này chứng tỏ sử dụng kết hợp HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l để khử trùng các lát cắt mỏng củ có đường kính d ≤ 1,5 cm có ảnh hưởng nhiều đến khả năng cảm ứng callus, Tuy nhiên việc tăng thời gian khử trùng bằng cefotaxime 800 mg/l lên đã làm tăng tỷ lệ sạch mẫu từ 11,69% ở CT3 lên 28,22% ở CT4 và từ 33,53% ở CT1 lên 56,25% ở CT2 nhưng đồng thời khả năng cảm ứng callus cũng giảm xuống tương ứng từ 10,4% ở CT1 xuống 4,8% ở CT2 và từ 10,2% ở CT1 xuống 2,3%, Đồng thời callus hình thành ở các công thức tăng thời gian khử trùng bằng cefotaxime 800 mg/l thì callus hình thành chỉ chủ yếu chiếm dưới 50% bề mặt mẫu.
Như vậy có thể sử dụng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l để khử trùng mẫu nhưng không nên khử trùng với thời gian quá lâu như thế sẽ ảnh hưởng tới khả năng cảm ứng callus, Công thức khử trùng tốt nhất đối với các mẫu Tam Thất có có đường kính d ≤ 1,5 cm là CT3: Khử trùng kép: Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (30 phút), Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép : 30 phút + 30 phút.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2
0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính 1,5 cm < d < 2 cm.
Ảnh hưởng của chế độ khủ trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime với củ Tam thất tương tựđược tiến hành với củ có đường kính 1,5 cm < d < 2 cm, Kết quả thu được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có