thứ cấp của các cây họ Sâm
Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa các tế bào phù hợp có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy. Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay, 2004 [37]). Rễ tơ được hình thành từ việc chuyển gen thực vật nhờ Agrobacterium rhizogenes cung cấp một số lượng lớn các vật chất sinh học là tiền đềđể tạo ra các hợp chất thứ cấp. Rễ tơ tạo ra bởi Agrobacterium rhizogenes phát triển nhanh hơn, và được coi là di truyền ổn định (Zhou và cs, 2006 [71]). Việc chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp tức là tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Trong đó các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, các hợp chất hữu cơ, elicitor, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Wang, 2008 [60]). Các nghiên cứu chỉ ra rằng, một vài sản phẩm tích lũy trong rễ tơ ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ởđiều kiện tối ưu.
Trong môi trường nuôi cấy in vitro các tế bào thực vật thường đòi hỏi sự có mặt của các chất đi ều tiết sinh trưởng, chủ yếu là auxins và cytokinins . Trong quá trình nuôi cấy rễ tơ thì sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng ảnh hưởng rất nhiều đến tốc độ tăng trưởng cũng như sự tích lũy hợp chất thứ cấp mục tiêu. Rễ tơ chuyển gen của cây cà độc dược (Datura innoxia
quá trình chuyển hóa nitơ mới trong các mô rễ (Ford và cs, 1996 [19]). Trong một số thí nghiệm khác, sự khác biệt khi bổ sung phytohormones đã dẫn đến sự giảm đáng kể hoặc thậm chí ngừng sản xuất alkaloid (Robins và cs, 1991 [45]). Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng khi bổ sung các phytohormones đúng liều lượng sẽ làm tăng tốc độ tăng trưởng và tăng khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp. Như nuôi cấy rễ tơ của Artemisia
annua trên môi trường bổ sung năm loại phytohormones khác nhau gồm: auxins, cytokinins, ethylene, gibberellins (GA3) và acid abscissic (ABA) thì sinh khối cao nhất thu được khi bổ sung 1-5 mg/l ABA vào trong môi trường, trong khi bổ sung 0,5-1 mg/l 2 iP thì lại ức chế sự tăng trưởng của rễ nhưng kích thích sản xuất artemisinin gấp 2 lần (Pamela và cs, 2005 [42]). Trong thí nghiệm khác của Yu và cs (2006) [67], bổ sung 2,4 D, α-NAA và BA ở nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy rễ tơ Polygonum multiflorum. Kết quả cho thấy 0,1 mg/l 2,4 D đã gây ra ảnh hưởng có hại đến rễ tơ, ngược lại α-NAA và BA trong điều kiện nhất định có thể kích thích sự phát triển (0,3-0,4 mg/l BA; hoặc 0,4 mg/l α-NAA) và tăng sản xuất anthraquinones (0,4 mg/l BA).
Chuyển gen tạo rễ tơ nhằm nâng cao chất lượng saponin đã được thực hiện thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Tuy nhiên sự phát triển của nguồn rễ tơ chuyển gen còn chịu tác động của nhiều yếu tố như các chất điều tiết sinh trưởng, các dịch chiết hữu cơ, các hợp chất elicitor…. Nhiều loại nền môi trường đã được sử dụng cho sự phát triển của nguồn rễ tơ chuyển gen như MS, ½MS, B5, ½B5 ( Yu và cs, 2000 [66]; Kim, 2005 [28]; Wang và cs, 1990 [59]; Sivakumar và cs, 2005 [50]). Trong đó môi trường MS thích hợp cho Nhân Sâm Hàn Quốc (Sivakumar và cs, 2005 [50]; Yu và cs, 2000 [66]), còn môi trường ½MS thích hợp cho Nhân Sâm Bắc Mỹ (Wang và cs, 1990 [59]).
Để tăng hiệu quả phát triển của rễ tơ thì nền môi trường nuôi cấy thường được bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Như các mẫu củ Nhân Sâm Hàn Quốc sau khi lây nhiễm với chủng Agrobacterium rhizogenes A4 thì
chúng tiếp tục được cảm ứng trên môi trường có bổ sung 2,4 D, BA, Ki. Kết quả thu được tần số hình thành mô sẹo cao nhất chiếm 99,3% trên môi trường MS có bổ sung BA và Ki. Tuy nhiên mô sẹo lại có ít rễ bên. Mô sẹo phát triển cho nhiều rễ tơ nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D và 0,1 mg/l Ki ( Wang và cs, 2008 [60]). Đối với rễ tơ Nhân Sâm Hàn Quốc sau khi được lây nhiễm với Agrobacterium rhizogenes 15834 đã được lựa chọn và nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4 D cho kết quả sinh trưởng và phát triển tốt (Yang và cs, 2000 [63]). Rễ tơ cũng bắt đầu hình thành sau 6 tuần nuôi cấy khi lây nhiễm mô sẹo Nhân Sâm Hàn Quốc với chủng Agrobacterium rhizogenes A4 trong 15 giờ. Rễ tơ tạo thành tiếp tục được tách ra và nuôi trên môi trường MS lỏng có bổ sung 0,5-2 mg/l IBA trong điều kiện tối và lắc ở tốc độ 140 vòng/phút (Nguyễn thị Hạ Hương, 2011) [3]. Với rễ tơ Nhân Sâm Hàn Quốc hình thành do bị nhiễm chủng
Agrobacterium rhizogenes KCTC 2703 thì lại cho kết quả sinh trưởng và phát triển tốt khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l α-NAA và 30 g/l sucrose (Yu và cs, 2003 [65]). Cũng bị lây nhiễm với chủng Agrobacterium
rhizogenes KCTC 2703 nhưng trong nghiên cứu của Sivakumar và cs (2005) [50] thì rễ tơ Nhân Sâm Hàn Quốc lại phát triển tốt trên môi trường MS lỏng lắc 100 vòng/ phút. Nhưng theo nghiên cứu của Kim và cs (2005) [28] thì các dòng rễ tơ Nhân Sâm được tạo thành sẽ sinh trưởng tốt khi chúng được cắt thành các đoạn dài 1cm và nuôi trên môi trường SH lỏng lắc 60 vòng/ phút ở 250C trong điều kiện tối.
Các dịch chiết hữu cơ như peptone, dịch chiết nấm men cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của rễ tơ. Bổ sung 300 mg/l peptone vào môi trường nuôi cấy sau 4 tuần đã cho thấy hiệu quả cho sự tăng tích lũy ginsenoside (Sivakumar và cs, 2005 [50]; Yu và cs, 2000 [66]). Dịch chiết nấm men bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã làm cho sự phát triển của rễ tăng lên 0,8 lần so với đối chứng nhưng làm tăng tốc độ tổng hợp saponin lên 1,17 lần (Jeong và cs, 2005) [27]. Bổ sung cả dịch chiết nấm nem và methyl jasmonate đã cải thiện đáng kể việc tổng hợp saponin, trong đó ginsenoside
tăng lên 2,07% trọng lượng khô. Mặt khác 2,4 D tương tác với methyl jasmonate đã làm tăng hiệu quả biểu hiện, điều này làm hạn chế việc sử dụng 2,4 D với liều lượng cao (Lu và cs, 2008 [34]). Dịch chiết nấm men và 10 mmol/l AgNO3đã làm tăng tốc độ phát triển của rễ tơ và tăng tích lũy saponin ở Nhân Sâm Hàn Quốc (Zhou và cs, 2003 [70]).
Các acid amin cũng có ảnh hưởng tới sự phát triển của nguồn rễ tơ chuyển gen. Nhân Sâm trồng ở Trung Quốc (Acanthopanax gracilityusaceae
Panax) sau khi lây nhiễm bằng chủng Agrobaterium rhizogenes A4 nguồn rễ tơđã được tạo thành. Bổ sung L-Phenylalanine với nồng độ 3 mg/l và 4 mg/l đã tác động tới sự phát triển của rễ Nhân Sâm Trung Quốc làm cho sản lượng tăng lên tương ứng là 23,04%, 22,83%. Tuy nhiên, việc bổ sung L-
Phenylalanine lại không có hiệu quả trong việc tích lũy saponin. Khi bổ sung Sodium pyruvate, L-Phenylalanine và P-aminobenzoic acid đã làm tăng lượng protein trong rễ tơ chuyển gen lên 2,245% cao hơn nhiều so với rễ không có tác động của chúng. Bổ sung 4 mg/l L-Phenylalanine đã làm cho
polysaccharide trong rễ tơ tăng 12,32% cao hơn nhiều trong rễ Nhân Sâm trồng là 7,6% (Wu và Zhong, 1999 [61]).
Nhiều hợp chất elicitor đã được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng hiệu quả tổng hợp các hợp chất thứ cấp . Như acid salicylic (SA) đã làm tăng khả năng tổng hợp saponin khi bổ sung với một lượng thấp vào môi trường 0,1-0.5 mM. Acetylsalicylic acid (ASA) đã làm tăng sự tổng hợp saponin lên 1,1 lần khi bổ sung vào với lượng thấp 0,1-1 mM (Jeong và cs, 2005) [27]. Jasmonic acid với liều lượng 1-5 mg/l khi bổ sung vào môi trường đã cải thiện mạnh mẽ việc tổng hợp saponin (Yu và cs, 2000 [66]; Sivakumar và cs, 2005 [50]). Hàm lượng ginsenosid sản xuất lớn nhất khi bổ sung 2 mg/l jasmonic acid (Yu và cs, 2003 [65]). Bổ sung kết hợp 25 µM indole-3-butyric acid với 100 µM methyl jasmonate trong môi trường rễ tơ Nhân Sâm đã tăng cường tích lũy ginsenoside lên so với việc bổ sung 100 µM methyl jasmonate (Yun-Soo và cs, 2007) [68].
PHẦN III: NỘI DUNG KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN
CHƯƠNG I: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng: Cây Tam thất hoang (Panax stipuleanatus)
Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla)
Thời gian: tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012.
Địa điểm: Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội.
1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu (đã được điều chỉnh theo quyết định số 3369/QĐ-BKHCN)
Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu
Nội dung 1.1 Thu thập, lưu giữ nguồn gen/vật liệu hai loài dược liệu Tam thất, Ngũ gia bì chân chim từ các địa phương trong nước.
Ở nước ta, trong các cây dược liệu quý có chứa hợp chất saponin có giá trị thì hai loài là cây Tam thất, Ngũ Gia bì chân chim bản địa là những đối tượng có ý nghĩa và đáng quan tâm. Tuy nhiên, với sự phân bố đặc thù của mỗi loài cây thì việc thu thập chúng có sự khác biệt. Đối với cây Ngũ gia bì chân chim, loài cây này mọc nhiều ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, hay gặp nhất là ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Sapa (Lào Cai), Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang (Đỗ Tất Lợi, 2003) [1]. Đối với cây Tam thất, loài cây này thường mọc ở miền Bắc Việt Nam, ở độ cao 1900-2400m trong rừng ẩm. Cây mọc hoang ở vùng núi cao lạnh thuộc huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Hoàng Su Phì (Hà Giang), Mường Khương, Bắc Hà, Xi Ma Kai, Sapa (Lào Cai) và các tỉnh Cao Bằng, Lai Châu. Chính sự phân bố đa dạng của hai đối tượng nghiên cứu mà chúng tôi
tiến hành thu thập và lưu giữ nguồn gen của cây Tam thất và cây Ngũ gia bì chân chim để phục vụ cho nghiên cứu.
¾ Thu thập nguồn gen cây Ngũ Gia bì chân chim
Cây Ngũ gia bì chân chim được tiến hành thu thập ở 2 địa phương: Gia Lâm – Hà Nội và Sa Pa – Lào Cai. Bộ phận thu thập là các cành lá tươi và cây còn sống của cây Ngũ Gia bì chân chim. Mô tảđặc điểm thực vật học của mẫu thu thập được. Tiến hành lưu giữ nguồn gen cây ngũ gia bì chân chim phục vụ nghiên cứu.
¾ Thu thập nguồn gen cây Tam thất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cây Tam thất được tiến hành thu thập ở 2 địa phương: Hà Giang và Sa Pa – Lào Cai. Bộ phận thu thập là các cành lá tươi, cây còn sống , rễ củ và hạt của cây Tam thất. Mô tả đặc điểm thực vật học của mẫu thu thập được. Xác định loài chính xác của mẫu thu thập được bằng việc nhân dòng gen 18S với cặp mồi tham khảo dưới đây:
STT Tên mồi Trình tự mồi Kích thước
Sản phẩm Nguồn gốc 1 18S- Panax- F 5’- CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3’ 1809bp Katsuko Komatsu và cs (2000) 2 18S- Panax- R 5’- CTG ATC CTT CTG CAG GTT CAC CTA C-3’
Sản phẩm của nhân dòng sau khi được tinh lọc được giải trình tự phục vụ cho việc phân tích phân loại phân tử, xác định đúng loài Tam thất. Tiến hành lưu giữ nguồn gen Tam thất phục vụ nghiên cứu.
Nội dung 1.2 Nhân nuôi và bảo quản các chủng vi khuẩn Agobacterium rhizogenes
- Vi khuẩn được lấy ra khỏi tủ lạnh sâu -80oC nuôi trên môi trường LB/AB/YM đặc (thành phần môi trường được trình bày trong phụ lục) bằng phương pháp cấy vạch trên đĩa Petri, sau đó nuôi ở tủấm 28oC trong 48 - 72h. Sau 72h quan sát so sánh sự phát triển của khuẩn trên đĩa thạch trên các loại môi trường khác nhau.
- Sau khi thu được khuẩn lạc đơn trên môi trường đặc, khuẩn lạc đơn được kiểm tra PCR với các cặp mồi đặc hiệu RolA,B,C.
Tên mồi Trình tự mồi
RolA-234F CAG AAT GGA ATT AGC CGG ACTA
RolA-541R TTA ATC CCG TAG GTT TGT TTC
RolB-61F ATG GAT CCC AAA TTG CTA TTCC
RolB-823R GTT TAC TGC AGC AGG CTT CAT G
RolC-18F ATG GCT GAA GAC GAC CTG TGT
RolC-577R GCC GAT TGC AAA CTT GCA CTC
- Khuẩn sau khi kiểm tra PCR xác định sự có mặt của gen chuyển được nuôi cấy trên môi trường tối ưu đặc theo phương pháp cấy vạch để trên đĩa Petri, nuôi ở tủấm 28oC trong 48 - 72h. Khuẩn lạc đơn được nuôi trong 10ml tối ưu lỏng ở 28oC với 200 vòng/ phút trong vòng 18-20h. Dịch khuẩn thu được lưu giữ trong glycerol 40% trong tủ -80oC.
Nội dung 2: Nghiên cứu khảo sát sự cảm ứng hình thành rễ tơ cho 02 loài dược liệu nghiên cứu
Nội dung 2.1 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro cho hai loài cây dược liệu
+ Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro cho cây Tam thất
0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính d ≤ 1,5 cm.
Công thức Chếđộ khử trùng CT1 Khử trùng kép:
+ Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (20 phút ) + Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 30 phút
CT2 Khử trùng kép:
+ Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (20 phút ) + Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép : 30 phút + 60 phút
CT3 Khử trùng kép:
+ Bước 1: Lắc HgCl2 0,1%: lần 1 (20 phút ) + lần 2 (30 phút ) + Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép : 30 phút + 30 phút
CT4 Khử trùng kép:
+ Bước 1: Lắc HgCl2 0,1% : lần 1( 20 phút) + lần 2 (30 phút) + Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 60 phút
- Phương pháp khử trùng:
+ Rửa dưới vòi nước chảy cho tới khi mẫu sạch các vết bẩn trên bề mặt. Tiếp theo lắc xà phòng loãng 20 phút sau đấy rửa lại mẫu nhiều lần bằng nước sạch cho tới khi hết bọt. Cắt mẫu thành các đoạn dài từ 2-3 cm.
+ Mẫu được đưa vào trong box cấy tráng qua nước cất vô trùng 2-3 lần. Tiếp theo lắc cồn 700 trong vòng 2 phút sau đấy rửa lại bằng nước cất vô trùng 1-2 lần. Sau đó xử lý mẫu bằng cách khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% và cefotaxin 800 mg/l: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 1: Lắc mẫu với HgCl2 0,1% + 2-3 giọt Tween 80 từ 15- 30 phút. Sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 2-4 lần. Tiếp tục lắc mẫu tiếp với HgCl2 0,1% + 2-3 giọt Tween 80 từ 15-40 phút. Sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng 4-5 lần.
Bước 2: Lắc cefotaxin 800mg/l từ 10- 60 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần. Lắc tiếp mẫu bằng cefotaxin 800mg/l khoảng 30 -60 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần.
+ Mẫu được cắt thành lát dày 2 mm và cấy vào các bình môi trường Môi trường nền sử dụng cho tất cả các thí nghiệm: MS + 1 mg/l 2,4D + 30g/l saccarose + 7g/l agar, pH=5.7. Dung dịch HgCl2 0,1% có bổ sung 2-3 giọt Tween 80. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính 1,5 cm < d < 2 cm. Công thức Chếđộ khử trùng CT1 Khử trùng kép: + Bước 1: Lắc HgCL2 0,1%: lần 1 (30 phút) + lần 2 (30 phút) + Bước 2: Lắc cefotaxin 800 mg/l kép: 30 phút + 30 phút CT2 Khử trùng kép: + Bước 1: Lắc HgCL2 0,1%: lần 1 (30 phút) + lần 2 (30 phút) + Bước 2: Lắc kháng sinh cefotaxime 800 mg/l kép: 30 phút + 60 phút
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2