¾ Các chủng Agrobacterium rhizogenes và khả năng tạo rễ tơ
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn đất gram (-) có khả năng lây nhiễm vào các mô thực vật và dẫn đến sự hình thành của rễ ngẫu được gọi là "rễ tơ". Bộ gen của vi khuẩn có chứa các Ri plasmid (PRI). Trong PRI, khu vực VIR tập trung 6-8 gen liên quan đến việc chuyển giao DNA. T- DNA có vùng bờ trái và bờ phải (T R-DNA và T L-DNA ) của PRI chính là các trình tự biên, là những khu vực được chuyển giao cho cây. Khu vực PRI có chứa các gen rol A, B, C và D, và các gen có vai trò tăng cường tổng hợp auxin (tms1 và tms2 chỉ đạo tổng hợp của IAA), cytokinin. Trong đó, gen rol
mặt khác còn cho kiểu hình bất thường nên gen này không có ứng dụng nhiều trong thực tế ngoại trừ việc tạo ra gốc rễ lùn. Gen rol B có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng tạo rễ tơ, làm tăng khả năng tăng trưởng và phân nhánh của rễ bằng cách tạo ra auxin. Gen rol C thì có ảnh hưởng nhiều tới hình thái của rễ tạo thành làm tăng khả năng phân nhánh. Gen này cũng chính là gen
rol duy nhất hoạt động tác động tới cây thông qua tác động của cytokinin do chúng tạo ra. Nếu có mặt của cả 3 gen rol ABC thì khả năng cảm ứng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp cũng tăng hơn rất nhiều. Tuy nhiên do sự tương tác của cả 3 gen nên khả năng biểu hiện và cảm ứng rễ tơ đôi khi không tốt bằng sự biểu hiện của một mình gen rol A. Gen rol D chỉ có rất ít trong các chủng
Agrobacterium rhizogenes và chúng là gen duy nhất không có khả năng cảm ứng hình thành rễ tơ mà chỉ có tác động hỗ trợ các gen rol khác (Christensen và cs, 2009) [15].
Hầu hết các nguyên liệu thực vật như lá cây, thân cây, cuống lá, lá mầm hoặc củđều có thểđược sử dụng để tạo ra nguồn rễ tơ chuyển. Quá trình lây nhiễm bởi chủng Agrobacterium rhizogenes đặc trưng bởi bốn bước sau đây:
+ Thực vật bị thương tạo ra các hợp chất phenolic là các chất độc vết thương nhằm làm cứng vết thương, đây cũng chính là chất dẫn dụ vi khuẩn.
+ Vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tế bào qua các vết thương. + Hoạt hóa các gen vùng Vir hoạt động.
+ Chuyển giao và hội nhập của các DNA vi khuẩn (T-DNA) vào hệ gen thực vật (Zupan và Zambryski, 1997 [72]).
Nhiều chủng Agrobacterium rhizogenes hoang dã đã được sử dụng để tạo nguồn rễ tơ tạo dược liệu, chúng có thể được phân loại theo cách thức biểu hiện gồm: Chủng Agropine (ví dụ: A4, 15834, 1855, LBA 9402) sản xuất agropine, mannopine và axit agropinic. Chủng Mannopine (8196) và
chủng Cucumopine chỉ sản xuất ra một sản phẩm tương ứng là mannopine và cucumopine. Khi xâm nhập vào mô thực vật chủng Agropine chuyển cả T L-
DNA và T R-DNA vào bộ gen của cây trồng, trong khi các chủng Mannopine và Cucumopine chỉ chuyển T L-DNA (Petit và cs, 1983 [44]). Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn để tạo rễ tơ còn phụ thuộc vào khả năng nhiễm khuẩn của các loài thực vật và độ độc của vi khuẩn đó. Ví dụ: sử dụng lây nhiễm các chủng
Agrobacerium lên cây một lá mầm khó khăn hơn trên cây hai lá mầm. Chủng
Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 đã không thành công khi chuyển gen vào hypervirulent do tính nhạy cảm cao nhưng đã sử dụng thành công trong việc tạo rễ tơ trên Hyoscyamus (Bensadek và cs, 2008).
Bên cạnh việc sử dụng các chủng hoang dã, các chủng vi khuẩn biến đổi gen với trình tự PRI đã được sửa đổi kết hợp với plasmid của
Agrobacterium tumefaciens tạo thành các vector đồng liên hợp hoặc nhị hợp cũng được sử dụng. Các chủng này được cải tiến có chứa promoter mạnh như
CaMV35S và các gen chỉ thị dễ phát hiện như gen GFP (Agrobacterium
rhizogenes GFP), gen β-glucuronidase, gen mã hóa hạn chế các enzyme:
tryptophan decarboxylase (TDC) và strictosidine synthase (str).
¾ Các điều kiện chuyển gen vào thực vật và khả năng tạo rễ tơ trên các cây họ Sâm bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Chuyển gen là một hiện tượng ngẫu nhiên nên xác suất rất khác nhau trong các lần chuyển. Để quá trình chuyển gen thành công phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như mẫu thực vật, nồng độ vi khuẩn, các chất kháng sinh, chất dẫn dụ vi khuẩn.
Thông thường chuyển gen người ta có thể sử dụng tất cả các nguồn vật liệu thực vật nhưng các vật liệu non sẽ cho hiệu quả cao hơn do khả năng cảm ứng tốt hơn và sự xâm nhập của vi khuẩn vào các mẫu non cũng dễ dàng hơn. Như chuyển gen thành công vào phôi soma ở cây Astragalus sinicus L. và tái sinh tạo ra nguồn rễ tơ trên môi trường có bổ sung 7,5-10 mg/l 2,4 D. Các chồi Robinia pseud oacacia L. sau khi được bắn gen và cho tái sinh trên môi trường có bổ sung 10 mg/l α-NAA và 5 mg/l BA cũng đã tạo được nguồn rễ
tơ (Hu và Du, 2006) [25].
Sử dụng các dòng vi khuẩn khác nhau và mật độ khác nhau của chúng cũng ảnh hưởng rất nhiều tới kết quả chuyển gen. Trong chuyển gen vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường MS, LB, YM đặc hoặc lỏng lắc ở 28oC sau đó thu sinh khối và đo mật độ vi khuẩn (OD600) trước lây nhiễm. Trên cây
Fagopyrum tataricum nguồn rễ tơ đã được tạo thành sau 30 ngày lây nhiễm bằng chủng Agrobacterium rhizogenes R1000 với mật độ vi khuẩn OD600= 0,5 (Nam và cs, 2011 [39]). Papaver somniferum L., 4-5 tuần sau lây nhiễm với các chủng Agrobacterium rhizogenes 13333, 15834, C58C1, R1000, và
R1200 sẽ tạo ra nguồn rễ tơ với mật độ vi khuẩn OD600= 0,5 khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường LB lỏng và OD600= 1 khi nuôi cấy trên môi trường B5 (Park và cs, 2000 [43]). Chủng Agrobacterium rhizogenes 1855 được nuôi ở 28°C trên YMB trong thời gian từ 24-36 giờ để thu được OD600= 0,4 sử dụng lây nhiễm trên các loại cây ăn quả như hạnh nhân, táo, mận. Kết quả sau 3 tuần thì rễ tơ đã bắt đầu xuất hiện (Damiano và Simona, 1998) [17]. Các chủng
Agrobacterium rhizogenes R1601, ATCC15834, A4, được nuôi trên YMB sau 24 giờ OD600= 0,2 – 1,5 được dùng lây nhiễm trên lá ngô H99 và sau 2-3 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh đã tạo ra nguồn rễ tơ (Xu và cs, 2006 [62]).
Nhân Sâm là cây thảo lâu năm, có phản ứng rất nghiêm nghặt với điều kiện canh tác. Việc trồng chúng trong tự nhiên gặp rất nhiều khó khăn. Thông qua sự lây nhiễm các Agrobacterium rhizogenes để tạo ra nguồn rễ tơ cung cấp một lượng lớn saponin đã góp phần khắc phục những khó khắn đó. Nhiều chủng Agrobacterium rhizogenes đã được sử dụng thành công để chuyển gen trên cây Nhân Sâm như các chủng Agrobacterium rhizogenes hoang dại TR7, 15834, A4 hay các chủng Agrobacterium rhizogenes đã được cải tạo di truyền như LBA 9402, KCTC 2703 ( Yu và cs, 2000 [65]; Yang và cs, 2000 [63]; Wang và cs, 2008 [60]). Để tạo ra nguồn rễ tơ chuyển gen phụ thuộc rất nhiều vào quá trình lây nhiễm. Ví dụ chủng Agrobacterium rhizogenes A4 khi lây
nhiễm vào Nhân Sâm Hàn Quốc thì để tăng hiệu quả lây nhiễm trên rễ thì rễ được gây tổn thương cơ học, sau đó cho lây nhiễm với mật độ vi khuẩn OD600 = 0,6 (http://www.rescancer.com/stomach-cancer/9609.html [78]). Rễ tơ Nhân Sâm cũng được tạo ra bằng cách lây nhiễm chủng Agrobacterium rhizogenes KCTC 2703 với các lát cắt củ dày 5 mm từ củ Nhân Sâm 6 tuổi sau khi được khử trùng sạch (Sivakumar và cs, 2005 [50]). Tuy nhiên, chủng vi khuẩn khác nhau cũng có khả năng cảm ứng khác nhau. Khi chuyển gen vào các phần cuống lá của Panax ginseng bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và MAFF 03-01.724. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn khác nhau có khả năng cảm ứng khác nhau và chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 cho cảm ứng rễ tơ tốt hơn đồng thời khả năng tổng hợp ginsenosides cũng nhiều hơn (Shu và cs, 1999 [52]). Bên cạnh đó khả năng cảm ứng rễ tơ của các gen rol cũng rất khác nhau. Các gen rol A và rol
B có ảnh hưởng rất nhỏ tới khả năng cảm ứng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong khi đó gen rol C lại đóng vai trò quan trọng trong việc tăng tổng hợp ginsenosides trong rễ tơ Nhân Sâm (Gorpen và cs, 2006) [23].
Quá trình lây nhiễm vi khuẩn tạo ra các hợp chất opines như acetosyringone để làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Chính vì thế trong chuyển gen nhân tạo thì việc sử dụng nồng độ acetosyringone bao nhiêu là rất cần thiết cho việc làm tăng hiệu quả lây nhiễm. Nồng độ acetosyringone tối ưu sử dụng để chuyển gen thường thay đổi khác nhau phụ thuộc vào các đối tượng thực vật khác nhau. Ví dụ: Đối với Torenia fournieri, chỉ cần nồng độ acetosyringone thấp (10-30 mM) đã làm tăng cường quá trình chuyển đổi. Nhưng đối với Nicotiana tabacum hoặc Papaver somniferum L. thì nồng độ acetosyringone sử dụng khá cao 50 - 150 mM mới cho hiệu quả (Kumar và cs, 2006 [31]). Theo Ngô Thị Tú Trinh (2011) [2] khi sử dụng chuyển gen trên cây Đinh lăng thì nồng độ acetosyringone thường sử dụng cho lây nhiễm để tạo ra nguồn rễ tơ là 200 µM.
Sau quá trình đồng nuôi cấy vi khuẩn thường được loại bỏ bằng kháng sinh sau đó tiếp tục được nuôi trên môi trường chọn lọc có kháng sinh để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Cefotaxime (250-500 mg/l) và Timentin (200-300 mg/l) thường được sử dụng để loại bỏ vi khuẩn. Tuy nhiên nồng độ này có sự thay đổi đối với các đối tượng thực vật khác nhau. Ví dụ: Trên các loại cây ăn quả như hạnh nhân, táo, lê thì sau khi nuôi cấy trên môi trường MS chúng được chuyển sang môi trường có chứa cefotaxime 250 mg/l để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn (Damiano và Simona, 1998) [17]. Bốn chủng thuộc loài Hyoscyamus được loại bỏ vi khuẩn bằng cách rửa trong môi trường có chứa 500 mg/l cefotaxime (Akramian và cs, 2008) [7]. Đối với cây Rhodiola
sachalinensis ngoài 500 mg/l cefotaxime thì môi trường rửa khuẩn còn bổ sung thêm 250 mg/l carbenicilin (Zhou và cs, 2003 [70]).
Vi khuẩn tiếp tục được loại bỏ khỏi mẫu trên môi trường chọn lọc. Do lượng vi khuẩn trên mẫu đã được rửa qua kháng sinh nên trên môi trường chọn lọc thường có bổ sung kháng sinh với nồng độ thấp. Trong thời gian nuôi cấy vi khuẩn sẽ bị ức chế phát triển và mẫu sẽ cảm ứng tạo nguồn rễ tơ. Tuy nhiên trên nhiều loại cây khác thì quá trình cảm ứng phải được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung thêm các phytohormone kết hợp với các yếu tố khác. Như Fagopyrum tataricum được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung vitamin ( 0,5 mg/l acid nicotinic, 0,5 mg/l pyridoxine HCl, 0,1 mg/l thiamine-HCl, và 2,0 mg/l glycine), 30 g/l sucrose, 500 mg/l cefotaxime, và 8 g/l agar. Rễ tơ đã được quan sát thấy nổi lên từ vết thương trong vòng 2 tuần trong bóng tối ở 25°C (Akramian và cs, 2008) [7]. Papaver somniferum
L. sau khi lây nhiễm được chuyển sang môi trường B5 có bổ sung 30 g/l sucrose, 50 mg/l paromomycin, 200 mg/l timentin và 8 g/l phytagar . Rễ tơ hình thành trong điều kiện bóng tối ở 25°C sau 4 tuần trên các vết thương (Park và cs, 2000 [43]). Trên cây ngô, rễ tơ hình thành sau 3 tuần cấy chuyển sang môi trường MS + 1,6 mg/l ZT + 0,3 mg/l α-NAA trong điều kiện tối ở 28oC (Xu và cs, 2006 [62]).
Trong một số trường hợp để kích thích cho rễ tơ phát triển nhanh thì người ta thường cấy chuyển sang môi trường mới. Ví dụ: sau 4-5 tuần lây nhiễm nhiều rễ tơ Papaver somniferum L. đã nổi lên từ các vết thương. Rễ có lông tiếp tục được tách ra thành các rễđơn và cụm rễ nuôi trên môi trường B5 lỏng có bổ sung 50 mg/l paromomycin và 200 mg/l timentin. Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở mức 25°C trên một tủ lắc 100 vòng/ phút có bố trí đèn huỳnh quang với tỷ lệ ánh sáng là 35 mmol/s/m và thời gian chiếu sáng là 16 giờ (Park và cs, 2000 [43]). Fagopyrum tataricum sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 tuần thì rễ tơ cũng bắt đầu xuất hiện. Các rễ phát triển tốt được cấy chuyển sang 30 ml môi trường MS lỏng, có chứa 30 g/l sucrose trong bình 100 ml. Mẫu được giữở 250C trong tủ lắc 100 vòng/ phút có bố trí đèn huỳnh quang với tỷ lệ ánh sáng là 35 mmol/s/m và thời gian chiếu sáng là 16 giờ (Akramina và cs, 2008).
Để phát hiện được rễ tơ chuyển gen thông thường người ta sẽ phân tích để kiểm tra sự có mặt của T-DNA. Quá trình này thường sử dụng kỹ thuật PCR (Kumar và cs, 2006 [31]) hoặc PCR kết hợp với phương pháp Sourthern blot (Tiwari và cs , 2007 [56]). Do các chủng hoang dại chỉ mang mình gen
rol chính vì vậy việc sử dụng vector nhị phân mang các gen chỉ thị đã tỏ ra hữu ích trong việc đánh giá sự có mặt của gen chuyển vào hệ gen của cây. Gen chỉ thị thường được sử dụng là các gen chọn lọc kháng thuốc kháng sinh như nptII hoặc HPT mã hóa tương ứng cho các enzyme neomycin
phosphotransferase hoặc hygromycin-phosphotransferase được thể hiện trong các mô chuyển đổi. Một nghiên cứu khác trên Astragalus sinicus L. và Glycine
max thì lại sử dụng thông tin phản hồi không nhạy cảm với synthase anthranilate (ASA2) bằng cách sử dụng cDNA phân lập từ 5-methyl tryptophan của một dòng tế bào kháng thuốc. Gen chuyển có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp nhuộm màu kết hợp với sử dụng kính hiển vi huỳnh quang sau khi chuyển đổi với các vector nhị phân có chứa gen