2. Đề xuất
1.2.1. Xác định vi khuẩn A hydrophila
Trên môi trường Nutrient Agar ở nhiệt độ 29oC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng, tròn, lồi, nhẵn, kích thước 2 – 3cm. Nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm, hình dạng tế bào là trực khuẩn (Hình 4.4). Thử Catalase và Oxydase cho kết quả dương tính, thử O/F cho kết quả dương tính.Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa theo phương pháp truyền thống cho kết quả Arginine, Lysine, Glucose, Lactose, Arabino, Maltose, Mannitol, Manose, Sucrose dương tính, các phản ứng còn lại là âm tính. Tra theo bảng của Nicky B. Buller (2005) thấy các phản ứng của vi khuẩn trên chính là các phản ứng của vi khuẩn A. hydrophila.
Hình 4.3: Khuẩn lạc thuần A. hydrophila trên môi trường NA
Hình 4.4: Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila khi nhuộm gram Trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt phổ biến nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis và Plumb, 1979). A.hydrophila là một vi khuẩn khá phổ biến ở các ao hồ nước ngọt, đặc biệt là khi có sự hiện diện của nồng độ cao các chất hữu cơ (Kaper và ctv, 1981).
Cá rô đồng bị nhiễm nặng Trypanosama sp có khả năng đã bị bội nhiễm
A. hydrophila cơ hội (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2011).
Cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) nuôi bè dọc sông Nan, tỉnh Nakornsawan, Thái Lan, trong thời gian hai năm (1984 – 1985) bị bệnh nghiêm trọng, vi khuẩn tìm thấy phổ biến nhất, gần 90% cá bệnh bị nhiễm bởi A. hydrophila (Chanchit và ctv, 1986). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java, Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80 - 90% (Angka, 1990).
Vi khuẩn A. hydrophila gây ra những vết loét đỏ trên thân cá chép được nghiên cứu bằng cách gây nhiễm trở lại trên 100 con cá, có chiều dài 20cm. Kết quả khoảng 80% cá chết. Khảo sát sau khi cá chết, thấy những tổn thương đặc
trưng của bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết. A. hydrophila đã được tái phân lập từ cơ, gan và máu của tim (Saitanu và Wongsawang, 1982).
Vi khuẩn A. hydrophila cũng được xác định là tác nhân gây bệnh xuất huyết cho cá lóc (Ophicephalus striatus) (Tonguthai và ctv, 1989). Vi khuẩn này còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn được tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (Trần Anh Dũng, 2005).
1.2.2. Xác định vi khuẩn Aeromonas salmonicida
Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA (Nutrient Agar) ủ trong tủ ấm nhiệt độ 29oC sau 24h thấy mọc khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, đường kính khuẩn lạc từ 1,5 – 2mm. Nhuộm gram soi trên kính hiển vi bằng vật kính dầu (X100) thấy vi khuẩn là trực khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm (hình 4.6). Thử catalase và oxydase đều cho kết quả dương tính. Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa cho kết quả Citrate, Glucose, Arabino, Manose dương tính, còn lại đều âm tính. Theo bảng hệ thống phân loại vi khuẩn của Nicky B. Buller (2005) đây là A. salmonicida.
Hình 4.5: Khuẩn lạc thuần A. salmonicida trên môi trường NA
Hình 4.6: Hình dạng vi khuẩn A. salmonicida khi nhuộm gram Chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn A. salmonicida gây bệnh trên cá Rô đồng nhưng A. salmonicida được biết là tác nhân gây bệnh cho cá hồi. Phân tích 12 mẫu cá hồi bị xuất huyết lở loét và 4 mẫu cá khỏe thấy tỷ lệ xuất hiện loài vi khuẩn A. salmonicida tương đối cao (5/12 mẫu chiếm tỷ lệ 41,67%), nhưng phân tích trên mẫu cá khỏe không thấy xuất hiện loài vi khuẩn này (Võ Thế Dũng, http://fof.hcmuaf.edu.vn).
Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu cá he (Puntius altus) bị bệnh xuất huyết thấy xuất hiện các chủng vi khuẩn Aeromonas sp ( Phan Văn Ninh và ctv, 1993), trong đó có vi khuẩn A. salmonicida (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995).
Bệnh xuất huyết trên cá bống tượng do vi khuẩn A. salmonicida, A. hydrophila gây ra. Và vi khuẩn A. salmonicida, được thực nghiệm gây nhiễm trở lại, xác định vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995).
A. salmonicida đã được phát hiện trong các vết loét của các loài cá biển và cá nước ngọt khác nhau như cá chình, cá bơn, cá tuyết, cá vền, giống cá lăng,
1.2.3. Xác định vi khuẩn Aeromonas caviae
Giống như A. hydrophyla và A. salmonicida, A. caviae cũng phát triển trên môi trường Nutrient Agar ở nhiệt 29oC, sau 24 giờ xuất hiện khuẩn lạc màu trắng trong, to, đường kính khuẩn lạc 5 – 6mm. Nhuộm gram bắt màu gram âm, có dạng trực khuẩn, hình que dài (Hình 4.8). Thử Catalase và Oxydase cho kết quả dương tính. Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa theo phương pháp truyền thống cho các phản ứng dương tính như Arginine, Glucose, Maltose, Manose, Sucrose, còn lại là cho phản ứng âm tính. Tra theo bảng hệ thống phân loại của Nicky B. Buller ( 2005) thì loài vi khuẩn phân lập được là A. caviae.
Hình 4.7: Khuẩn lạc thuần A. caviae
trên môi trường NA
Hình 4.8: Hình dạng vi khuẩn A. caviae khi nhuộm gram
Cũng giống như A. hydrophila, A. caviae là vi khuẩn gắn liền với bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết của cá nước ngọt (Roberts, 1993).
Theo báo cáo của Araujo và ctv, 1990 thì A. caviae là loài chiếm ưu thế trong nước tại các trại sản xuất cá cảnh. Trong một nghiên cứu từ một vịnh ven biển ở Nhật Bản, Nakano và ctv (1990) tìm thấy vi khuẩn A. caviae là phong phú nhất.
nhất và có hại cho các loài cá nước ngọt đặc biệt là các loài cá da trơn, là một tác nhân gây bệnh nhiễm trùng ở cá. Khi sức đề kháng của cá giảm hoặc cá bị tổn thương do xây sát sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn A. caviae xâm nhập (Tạp chí khoa học nông nghiệp, 2012).
Hatha và ctv, 2005 báo cáo tại Ấn Độ vi khuẩn A. caviae gây bệnh cho các loài cá như cá vàng (Carassius auratus), cá chép (Cyprinus carpio). Đây là loài gây bệnh thứ hai trong một trang trại cá nước ngọt, chỉ đứng sau A. hydrophila.
1.2.4. Xác định vi khuẩn Flavobacterium columnare
Trên môi trường Nutrient Agar ở nhiệt độ 290C khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng (Hình 4.9). Nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm, hình dạng tế bào là trực khuẩn (Hình 4.10). Thử Catalase cho kết quả âm tính, Oxydase cho kết quả dương tính. Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa trên kít API 20E cho kết quả ONPG và GEL dương tính, các phản ứng còn lại là âm tính. Tra theo bảng của Nicky B. Buller (2005) thấy trùng khớp với vi khuẩn F. columnare.
Hình 4.9: Khuẩn lạc F. columnare trên môi trường NA
Hình 4.10: Hình dạng vi khuẩn F. columhae khi nhuộm gram.
Vi khuẩn F. columnare (trước đây vi khuẩn này có tên là Flexibacter columnaris) đã được công nhận là một tác nhân gây bệnh phổ biến trên nhiều loài cá nước ngọt trên toàn thế giới như gây hoại tử mang và tổn thương da cá nước ngọt (Bernoth và Korting, 1989; Alvarado và ctv, 1989; Balta và Cagirgan, 1998; Figueiredo và ctv, 2005; Frerichs và Roberts, 1989; Noga, 2000). Khả năng gây bệnh của vi khuẩn F. columnare trên các cơ quan bên ngoài của cá được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Theo mô tả của Tripathi và ctv (2005), Bader và ctv (2006), Pilarski và ctv (2008), vi khuẩn F. columnare phân lập chủ yếu ở da. Trong khi đó, Decostere và ctv (1999), Plumb (1999) và Morris và ctv (2006) cho rằng hầu hết vi khuẩn này được phân lập từ mang.
Ở Mỹ, nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn F. columnare gây thiệt hại hơn 70% trại ương nuôi cá nheo, gây tổn thất trên 50 triệu đô la hàng năm. Loài vi khuẩn này được xếp vào hàng thứ hai sau bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri về khả năng gây bệnh cũng như thiệt hại (Từ Thanh Dung, http://uv- vietnam.com.vn).
Mặc dù không tìm thấy F. columnare gây bệnh trên cá chình nuôi tuần hoàn ở nhiệt độ 25 ± 20C (Alvarado và ctv, 1989) và các tổn thương trên da cá mè 3 năm tuổi (Bernoth và Korting, 1989), nhưng được tìm thấy từ các tổn thương bên ngoài của cá chép nuôi (Bootsma và Clarx, 1976) và gây chết ở cá hồi vân giống (0,7-10 g) khi nhiệt dộ nước dao động 5-15 ° C (Rintamaki- Kinnunen và ctv, 1997).
Vi khuẩn F. columnare có thể lây nhiễm cho cá tra ở bất kỳ độ tuổi nào, dưới một loạt các điều kiện nước, và trong bất kỳ mùa nào trong năm (Griffin, 1992).
Phân lập vi khuẩn từ hai loài cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) và cá mè hoa (Aristichthys nobilis) của Malaysia nhập khẩu đa số thấy vi khuẩn bắt
màu gram âm trong đó có giống Flavobacterium phân lập trên các cơ quan thận, gan, ruột và mang ( Shamsudin, 1986).
Tóm lại:Chúng tôi đã tiến hành thu mẫu và phân lập được 4 loài vi khuẩn gây bệnh trên cá Rô đồng nuôi thâm canh tại Hải Dương là A. hydrophila, A. salmonicida, A. caviae, và F. columnare. Mặc dù mới chỉ có rất ít thông báo đã xác định được các loài vi khuẩn này có trên cá Rô đồng trong các giai đoạn phát triển của cá, nhưng đã có rất nhiều thông báo về các vi khuẩn này trên các loài cá nước ngọt của các tác giả. Kết quả phân lập cho thấy rằng cá Rô đồng nuôi thâm canh tại Hải Dương bị nhiễm 4 loài vi khuẩn trên, song tỷ lệ nhiễm thấp, do đó các loài vi khuẩn này có thể chỉ là một trong các tác nhân, hoặc chỉ là tác nhân cơ hội gây nên bệnh đen thân trên cá Rô đồng.
2. Kết quả thử kháng sinh đồ
Hình 4.11: Sơ đồ thử thuốc kháng sinh đối với VK phân lập được Vi khuẩn phân lập được
A. hydrophila 2,16 x 109 2,16 x 107 A. salmonicida 1,95 x 109 1,95 x 107 A. caviae 1,78 x 109 1,78 x 107 RA E Te Dx Nv F. columnare 1,52 x 109 1,52 x 107
Sau khi tìm ra tác nhân gây bệnh chúng tôi tiến hành chọn ra 5 chất kháng sinh để làm kháng sinh đồ: Rifampicin (RA), Erythromycine (E), Tetracycline (Te), Doxycyline (Dx), Novobiocin (Nv). Đây là những thuốc kháng sinh mà đa số vi khuẩn đã phân lập có tính mẫn cảm cao và hiện nay đa số người nuôi sử dụng (Bùi Quang Tề, 2002) và nằm trong danh mục các kháng sinh được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.
Hình 4.12: Kết quả thử kháng sinh đồ
Đồ thị 4.13: Đồ thị đường vòng vô khuẩn của kháng sinh đối với vi khuẩn
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn Aeromonas hydrophila có tính mẫn cảm cao nhất đối với kháng sinh Tetracycline ( đường kính vòng vô khuẩn trung bình >35 mm) ở cả 2 nồng độ.
Cùng 1 loại chất kháng sinh, vi khuẩn có tính mẫn cảm khác nhau ở các nồng độ khác nhau. Đối với kháng sinh Doxycycline, ở nồng độ vi khuẩn 2,16 x 107 thì vi khuẩn có tính mẫn cảm cao (đường kính vòng vô khuẩn trung bình >30 mm), ở nồng độ vi khuẩn 2,16 x 109 vi khuẩn lại có tính mẫn cảm trung bình. Đối với kháng sinh Erythromycin, ở nồng độ vi khuẩn 2,16 x 107 vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình (đường kính vòng vô khuẩn trung bình > 25mm), còn ở nồng độ vi khuẩn 2,16 x 109 vi khuẩn lại có tính mẫn cảm kém.
Ở 2 nồng độ vi khuẩn 2,16 x 107 và 2,16 x 109, đối với kháng sinh Rifampicin đường kính vòng vô khuẩn trung bình < 25mm chứng tỏ vi khuẩn A. hydrophila có tính mẫn cảm kém với kháng sinh này. Vi khuẩn A. hydrophila
không có tính mẫn cảm với kháng sinh Novobiocin do đường kính vòng vô khuẩn trung bình < 15mm.
Qua đó ta thấy dùng kháng sinh Doxycycline và Tetracycline tiêu diệt được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn A. hydrophila có hiệu quả hơn những kháng sinh khác.
Bùi Quang Tề (2002) cũng khẳng định Tetracycline được dùng để trị bệnh do vi khuẩn A. hydrophila gây ra trên động vật thủy sản nước ngọt. Kết quả trong nghiên cứu này trái ngược với ở Australia, một tỷ lệ lớn vi khuẩn A. hydrophila phân lập được trên cá nước ngọt đề kháng với kháng sinh Tetracycline và Rifampicin (Chang và Bolton, 1987), như vậy hai loại kháng sinh này không được dùng để điều trị bệnh do vi khuẩn A. hydrophila gây ra.
Cũng theo Hatha và ctv, 2005 vi khuẩn này cũng đề kháng với kháng sinh Novobiocin.
Đồ thị 4.14: Đồ thị đường vòng vô khuẩn của kháng sinh đối với vi khuẩn A. salmonicida.
Đối với vi khuẩn A. salmonicida ở nồng độ vi khuẩn 1,95 x 107 kháng sinh Doxycycline có đường kính vòng vô khuẩn to nhất (>30 mm) chứng tỏ tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với loại kháng sinh này là cao. Nhưng ngược lại ở nồng độ vi khuẩn 1,95 x 109 thì tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Doxycycline chỉ ở mức trung bình.
Tương tự như kháng sinh Doxycycline, ở nồng độ vi khuẩn 1,95 x 107 vi khuẩn A. Salmonicida có tính mẫn cảm cao với kháng sinh Tetracycline ( đường kính vòng vô khuẩn trung bình >30 mm) nhưng ở nồng độ vi khuẩn 1,95 x 109 vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình với kháng sinh này.
Đối với các kháng sinh còn lại vi khuẩn lại có tính mẫn cảm khác nhau ở 2 nồng độ vi khuẩn. Vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình với kháng sinh
Rifampicin, nhưng lại có tính mẫn cảm kém với kháng sinh Erythromycin và không có tính mẫn cảm với kháng sinh Novobiocin.
Vì vậy dùng 2 loại kháng sinh Doxycycline và Tetracycline có thể tiêu diệt được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn A. salmonicida.
Đồ thị 4.15: Đồ thị đường vòng vô khuẩn của kháng sinh đối với vi khuẩn A. caviae.
Nhìn vào đồ thị ta thấy hai loại kháng sinh Doxycycline và Tetracycline có đường vòng vô khuẩn to nhất (> 30 mm) ở cả 2 nồng độ vi khuẩn, chứng tỏ vi khuẩn A. caviae có tính mẫn cảm cao đối với 2 loại kháng sinh này. Do đó, có thể dùng 2 loại kháng sinh này để điều trị cho cá bị nhiễm bệnh do vi khuẩn A. caviae.
Riêng đối với kháng sinh Erythromycin thì vi khuẩn lại không có tính mẫn cảm. Các kháng sinh còn lại, tính mẫn cảm của vi khuẩn ở mức độ kém.
Đồ thị 4.16: Đồ thị đường vòng vô khuẩn của kháng sinh đối với vi khuẩn F. columnare
Qua đồ thị ta thấy hai kháng sinh Doxycycline và Tetracycline có đường vòng vô khuẩn to nhất (> 30mm) chứng tỏ tính mẫn cảm của vi khuẩn F. columnare đối với 2 loại kháng sinh này là cao nhất. Đối với kháng sinh Rifampicin và Novobiocin, ở cả 2 nồng độ vi khuẩn 1,52 x 107 và 1,52 x 109 vi khuẩn đều có tính mẫn cảm trung bình. Còn kháng sinh Erythromycin thì vi khuẩn có tính mẫn cảm kém.
Do đó, có thể dùng kháng sinh Doxycycline và Tetracycline để điều trị cho cá bị bệnh do vi khuẩn F. columnare.
Theo báo cáo của Ayse Kubilay và ctv (2008) thì vi khuẩn F. columnare
lại nhạy cảm với kháng sinh Erythromycin. Theo kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (Tạp chí Khoa học 2012:22c) đa số vi khuẩn F. columnare
gây bệnh trắng đuôi trên cá tra nhạy với thuốc kháng sinh rifampin và trên 85% vi khuẩn vẫn còn nhạy với ampicillin và tetracyclin.
Tóm lại: Tất cả các loài vi khuẩn mà chúng tôi đã phân lập được đều có tính mẫn cảm cao với kháng sinh Doxycycline và Tetracycline. Hầu như không có tính mẫn cảm hoặc tính mẫn cảm kém với kháng sinh Novobiocin. Do đó có thể dùng 2 kháng sinh là Docyxycline và Tetracycline để điều trị cho cá Rô đồng bị bệnh trong điều kiện nuôi thâm canh.
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận
1.1. Chúng tôi đã phân lập được 4 loài vi khuẩn trong tổng số 174 mẫu cá rô đồng nuôi thâm canh tại Hải Dương là: A. hydrophila, A. salmonicida, A. caviae, và F. Columnare với tỷ lệ nhiễm như sau:
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh do A. hydrophila: 6,32%
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh do A. salmonicida: 1,72%
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh do A. caviae: 4,6%
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh do F. columnare: 17,82%
1.2. Xác định được một số loại kháng sinh có tác dụng tốt trong phòng thí nghiệm:
+ Doxycycline và Tetracycline trị bệnh do vi khuẩn A. hydrophila, A. salmonicida, A. caviae và F. columnare gây ra.
2. Đề xuất
2.1. Cần tiến hành gây cảm nhiễm nhân tạo với 4 loài vi khuẩn đã phân lập được để có kết luận chắc chắn vi khuẩn có phải là tác nhân gây bệnh hay chỉ là tác nhân cơ hội.
2.2. Có thể sử dụng 2 loại kháng sinh: Doxycycline, Tetracycline để trị bệnh vi khuẩn cho cá Rô đồng nuôi ở mức quy mô nhỏ.
2.3. Cần tiếp tục nghiên cứu phòng trị bệnh vi khuẩn trên cá Rô đồng ở mức rộng hơn để xác định loại kháng sinh đặc trị các bệnh vi khuẩn cho cá Rô đồng nuôi ở quy mô nuôi rộng lớn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt