Trên thế giới một số nghiên cứu đã được tiến hành tìm hiểu mối tương quan giữa 25(OH)D3 và LL-37 trên một số nhóm bệnh nhiễm khuẩn khác nhau. Để nhằm mục tiêu tìm hiểu mối quan hệ giữa vitamin D và tình trạng sản xuất LL-37 yếu tố quan trọng với miễn dịch bẩm sinh. Cũng như vai trò tham gia kiểm soát các bệnh nhiễm trùng tại cộng đồng của vitamin D.
Nghiên cứu trên nhóm bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết và nhóm bệnh nhân nhiễm trùng nhập viện khác của Jeng L. và cộng sự năm 2009 nhận thấy 25(OH)D3 và LL-37 có mối tương quan thuận tích cực với r= 0,2385 [53].
Tuy nhiên một nghiên cứu khác trên 95 bệnh nhân lao phổi của Yamshchikov và cộng sự được báo cáo 2010 không thấy mối tương quan tuyến tính giữa hai đại lượng này. Bài báo chỉ ra rằng nồng độ LL-37 cao liên quan đến tình trạng mất cân (giảm hơn 10% trọng lượng) [80] .
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi gồm 2 nhóm: nhóm bệnh và nhóm chứng
2.1.1. Nhóm bệnh
* Tiêu chuẩn chọn:
Bệnh nhân nhi (≤15 tuổi) được chẩn đoán xác định là NKTN
Chúng tôi hướng tới các bệnh nhi có biểu hiện lâm sàng gợi ý đến NKTN. Các triệu chứng gợi ý NKTN theo lứa tuổi như sau:
Trẻ sơ sinh: Sốt hoặc hạ thân nhiệt, kém ăn, vàng da, chậm tăng cân, nhiễm khuẩn huyết.
Trẻ bú mẹ: Nôn, ỉa chảy, sốt, kém ăn, đái đục, khóc khi đái. Trẻ lớn: Đái buốt, đái rắt, đái dầm, đái đục, đái máu, sốt rét run
Kết quả xét nghiệm tổng phân tích và soi tươi tế bào niệu: Bạch cầu niệu (+). Tiêu chuẩn chẩn đoán: Kết quả nuôi cấy nước tiểu: Vi khuẩn niệu ≥ 105 /mL nước tiểu giữa dòng (tiêu chuẩn Kate Verries John) [55].
Chẩn đoán : NKTN trên: Sốt ≥3805, CRP >20mg/L NKTN dưới: Sốt < 38o5[55]
Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính, có các nhiễm khuẩn khác đi kèm.
2.1.2. Nhóm chứng
Gồm 36 trẻ khỏe mạnh không bị NKTN, không mắc các bệnh thận mạn tính và không bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn khác như nhiễm khuẩn hô ấp,
đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn da hoặc những trẻ đến khám sức khỏe định kỳ
tương ứng về tuổi và giới với nhóm nghiên cứu. Tiêu chuẩn: Vi khuẩn niệu(-)
Bạch cầu niệu(-)
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu.
- Lấy mẫu nghiên cứu tại khoa khám bệnh bệnh viện nhi TW.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Thu thập thông tin
Tất cả đối tượng nghiên cứu được khám lâm sàng và làm xét nghiệm cận lâm sàng theo mẫu bệnh án riêng.
* Khám bệnh
Hỏi bệnh
- Phát hiện các triệu chứng cơ năng của người bệnh + Các rối loạn tiểu tiện
+ Rối loạn màu sắc nước tiểu
+ Các triệu chứng toàn thân kèm theo
Khai thác yếu tố nguy cơ
+ Tiền sử mắc các dị dạng thận tiết niệu, bệnh thận mạn tính.
+ Tiền sử bản thân và gia đình (bố, mẹ, anh chị em ruột) bị mắc NKTN và số lần bị tái phát bệnh.
Khám bệnh
Khám toàn thân: Phát hiện các triệu chứng, biến chứng bất thường
Khám bộ phận thận tiết niệu sinh dục: Phát hiện các triệu chứng thực thể
và các dị dạng tiết niệu sinh dục ngoài.
* Cận lâm sàng
Bệnh nhi được làm các xét nghiệm cận lâm sàng:
Xét nghiệm nước tiểu làm test nhanh Multistic trên máy Cliniter advantus của Siemen và soi tươi tế tìm bạch cầu niệu tại bệnh viện Nhi TW.
Các mẫu nước tiểu có kết quả bạch cầu niệu (+) sẽ được lấy nước tiểu nuôi cấy VK. Cấy nước tiểu tìm VK và làm kháng sinh đồ tại khoa hóa sinh trường Đại học Y Hà nội.
Xét nghiệm huyết học, CRP tại bệnh viện Nhi TW.
Siêu âm thận tiết niệu, chụp UIV, chụp bàng quang khi đái tại khoa chẩn
đoán hình ảnh bệnh viện Nhi TW.
Những bệnh nhân có kết quả cấy vi khuẩn niệu (+) ( ≥ 105vi khuẩn/mL nước tiểu) sẽ được định lượng 25(OH)D3 huyết thanh và LL-37 huyết thanh. Mẫu máu bệnh nhân sau khi lấy không chống đông được ly tâm tách lấy mẫu huyết thanh. Mẫu bệnh phẩm là máu không chống đông hoặc huyết thanh sau khi lấy được bảo quản tối, ống nghiệm được bọc giấy thiếc để tránh ánh sáng trong quá trình vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -20oC khi lấy đủ số lượng nghiên cứu tiến hành định lượng 25(OH)D3 và LL-37. Mẫu huyết thanh sau khi phá đông tiến hành định lượng 25(OH)D3, LL-37 trong vòng 24h quy trình thực hiện xét nghiệm ở nhiệt độ phòng 18-250C.
* Cấy nước tiểu tìm vi khuẩn •Lấy nước tiểu
Lấy nước tiểu vào buổi sáng hoặc bất kỳ trong ngày. Lấy nước tiểu
đảm bảo vô khuẩn, bỏ nước tiểu đoạn đầu lấy đoạn giữa sau khi đã vệ
sinh bộ phận sinh dục hứng vào ống nghiệm đã tiệt trùng, rồi nút lại bằng bông đã hấp vô trùng.
•Bảo quản nước tiểu
Nước tiểu sau khi lấy được đem nuôi cấy ngay, nếu không phải bảo quản 0-4oC và cấy nước tiểu trong vòng 4h.
•Phương pháp nuôi cấy
Dùng ăng cấy chuẩn1/1000ml
Lắc đều ống nước tiểu trước khi cấy
Cấy vào môi trường thạch máu và thạch Chrome.
Ủ trong tủ ấm ở 370C từ 18-24h. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc từ đó tính ra số lượng vi khuẩn trong 1mL nước tiểu.
Sau đó vi khuẩn được cấy vào môi trường phân lập để định loại vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
Số lượng vi khuẩn được đánh giá như sau: số lượng vi khuẩn /mL nước tiểu ≥105 chẩn đoán NKTN.
Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch của Kirby- Bauer.
Thạch làm kháng sinh đồ là thạch Muller- Hinton
Khoanh giấy kháng sinh của hãng AB-Biodisk Thụy Điển. Xác định độ
* Định lượng 25(OH)D3
Nồng độ 25(OH)D3 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (electrochemiluminescence immunoassay). Trên máy Elecsys 2010, kit định lượng 25- Hydroxyvitamin D3 Cat.No 03314847 của Roche Diagnostics tại viện Karolinska Thụy Điển..
Nguyên tắc phản ứng: Nguyên tắc cạnh tranh Toàn bộ các giai đoạn 18 phút
Bước 1: 25(OH)D3 trong mẫu huyết thanh (35µl) được gắn cạnh tranh với vitamin D đã gắn với biotin trong phức hợp R2 (biotin- vitamin D- kháng thể đa dòng đặc hiệu kháng 25(OH)D3 đánh dấu bởi Ruthelium). Nồng độ
phức R2 còn lại phụ thuộc nồng độ 25(OH) D3 trong mẫu.
Bước 2: Thêm streptavidin- coated microparticies, phức hợp trở lên gắn kết thành pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin và streptavidin.
Bước 3: Hỗn hợp phản ứng được hút vào buồng đo lường ở đó nó được giữ lại trên bề mặt điện cực do từ tính. Các thành phần không gắn sẽ bi rửa đi cùng với Procell. Sau đó dùng một điện áp và điện cực để kích thích sự phát quang cường độ phát quang được xác định bởi bộ phận đo quang. Kết quả xác
định dựa vào một đường cong chuẩn bằng cách chuẩn hai điểm (đặc hiệu cho thiết bịđo) và đường cong gốc được cung cấp dựa vào mã vạch của thuốc thử.
Thuốc thử và dung dịch phản ứng
M Streptavidine-coated microparties, 1lọ 6.5ml
Streptavidine-coated microparties 0.072mg/ml; chất bảo quản R1 Đệm phản ứng reation buffer, 1lọ 8ml
R2 Anti-25-OH- vitamin D3-Ab-Ru(bpy): 25-OH-vitamin D3 derivate- biotin, 1lọ 9ml
Polyclonal anti-25-OH vitamin D3 antibody (cừu) gắn với phức hợp ruthelium1,5mg/L; biotinyl 25-OH vitamin D 0,15mg/L: phosphatase buffer 20mmol/L, pH 6,5; chất bảo quản
Đánh giá nồng độ 25(OH)D3được khuyến cáo là đủ vitamin D ≥ 30ng/mL
* Định lượng LL- 37 huyết thanh.
Nồng độ LL-37 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) kiểu sandwich. Kit định lượng LL-37 Cat.No HK321 (Hycult biotechology, Uden, The Netherlands) tại Viện Karolinska.
Toàn bộ các giai đoạn: 3 giờ 30 phút Nguyên tắc phản ứng:
Mẫu và chuẩn được ủ trong giếng có kháng thể LL-37 người.
Đưa kháng thể gắn biotin vào gắn với LL-37 người
Phức hợp Streptavidin- peroxidase gắn vào kháng thể có gắn biotin trong phức hợp.
Phức hợp Streptavidin- peroxidase sẽ gây phản ứng trên bề mặt, tetramethylbenzidine (TMB).
Phản ứng enzyme sẽ dừng lại khi thêm acid oxalic.
Kết quả đo sự hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 450nm.
Đường cong chuẩn được xác định bằng cách vẽ đường hấp thu tương ứng với với nồng độ LL-37 tiêu chuẩn. LL-37 của mẫu được xác định từ dường cong tiêu chuẩn.
2.3. Xử lý số liệu.
Sử dụng phương pháp thống kê y học và phần mềm Epi-info 6.0 Các thông số được tính:
- Giá trị trung bình - Độ lệch chuẩn: SD
- Hệ số tương quan: r và viết phương trình đường thẳng hồi quy: y = ax+ b - Các phép so sánh χ2 và test t. Nếu p < 0,5 coi là có ý nghĩa thống kê
2.4. Vấn đềđạo đức trong nghiên cứu
- Các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu - Các đối tượng nghiên cứu lấy máu, nước tiểu và phân tích các chỉ số
miễn phí
- Đối tượng hoàn toàn có thể rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốn tiếp tục tham gia vào nghiên cứu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhi NKTN 3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới tính.
Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo tuổi và giới tính
< 2 tuổi ≥ 2 tuổi Tổng n % n % n % Nam 21 31,8 18 27,3 39 59,1 Nữ 17 25,8 10 15,1 27 40,9 Tổng 38 57,6 28 42,4 66 100 Nhận xét:
Trẻ trai mắc nhiều hơn trẻ gái và nhóm trẻ dưới 2 tuổi mắc bệnh nhiều hơn. Tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.1.2. Phân loại NKTN. 72.7% 27.3% NKTN trên NKTN dưới Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ NKTN trên và NKTN dưới
Nhận xét:
NKTN trên chiếm tỷ lệ 27,3% (18/66 bệnh nhân). NKTN dưới chiếm tỷ
lệ 72,7%
Bệnh nhi dưới 2 tuổi chiếm 66,7% (12/18) trường hợp NKTN trên
3.1.3. Sự biến đổi của một số thông số huyết học Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm máu Kết quả xét nghiệm Số bệnh nhân Tỷ lệ % Hemoglobin (<11g/dl) 22 33,3 Số lượng bạch cầu tăng (>10 G/L) 40 60,6 Tỷ lệ bạch cầu trung tính tăng 34 51,5 CRP(>20mg/L) 22 33,3 Nhận xét:
Tỷ lệ bệnh nhân có biểu hiện thiếu máu 33,3%
Bạch cầu máu tăng 60,6% trường hợp. Tăng bạch cầu trung tính 51,5%. 33,3% bệnh nhân có tăng CRP>20mg/L
3.1.4. Kết quả xét nghiệm bạch cầu niệu Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm bạch cầu niệu Bạch cầu niệu Số bệnh nhân Tỷ lệ % (+) 1 1.5 (++) 4 6.1 (+++) và dày đặc 61 92.4 Tổng 66 100 Nhận xét: - Đa số các bệnh nhi có bạch cầu niệu rất nhiều (92,4%). 3.1.5. Kết quả phân lập vi khuẩn
Bảng 3.4. Tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được
Nam Nữ Chung Vi khuẩn n % n % n % E.coli 27 40,9 19 28,8 46 69,7 Proteus 5 7,5 5 7,5 10 15,3 Ent.feacalis 3 4,5 2 3.0 5 7.5 S.aereuse 1 1,5 0 0 1 1,5 Klebsiella 0 0 2 3,0 2 3,0 Samonella 1 1,5 1 1,5 2 3.0 Tổng 39 56,1 29 43,9 66 100 Nhận xét:
VK gây bệnh hàng đầu là E.coli 46 bệnh nhân (69,7%). Không có sự khác biệt tỷ lệ nhiễm E.coli theo giới (p>0.05).
3.1.6. Mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli. Bảng 3.5. Mức độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của E.coli Bảng 3.5. Mức độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của E.coli S I R Kháng sinh n % n % n % Amoxicilin 9 19.6 1 2.2 36 78.3 Cephalotine 21 45.7 3 6.5 22 47.8 Augmentin 39 84.8 1 2.2 6 23. Cefotaxim 17 37.0 4 8.7 25 54.45 Ceftazidime 33 71.7 6 13.0 7 15.2 Ceftriaxole 23 50 1 2.2 22 47.8 Ciprofloxacin 36 78.3 4 8.7 6 13.0 Gentamycin 28 60.9 1 2.2 17 37.0 Amikacin 41 89.9 1 2.2 4 8.7 Tobramycine 25 54.4 9 19.6 12 26.1 Cotrimoxazol 9 19.6 3 6.5 34 73.9 Fosmicin 45 97.8 0 0 1 2.2 Ertapenem 46 100 0 0 0 0 Nitrofurantoin 45 97.8 0 0 1 2.2 19.6% 45.7% 84.8% 37.0% 71.7% 50.0% 78.3% 60.9% 89.9% 54.4% 19.6% 97.8% 100.0% 93.9% 78.3% 47.8% 23.0% 54.4% 15.2% 47.8% 13.0% 37.0% 8.7% 26.1% 73.9% 2.2% 2.2%
AM CF AMC CTX CAZ CRO CIP GM AK TM SXT FOM ETP FT
S R
Nhận xét:
E.coli kháng mạnh với kháng sinh thông thường như Amoxicilin và Co-trimoxazol (78,3% và 73,9%).
Nhạy cảm với kháng sinh Augmentin 84,8%, Amikacin 89,9%, Ciprofloxacin 78,3%, Fosmicin 97,8%, Nitrofurantoin 97,8% và Ertapenem 100%.
Kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nhạy cảm thấp: cefotaxime 37%, ceftriaxole 50%.
3.2. Kết quả định lượng 25(OH)D3 và peptid LL-37 huyết thanh
Chúng tôi tiến hành định lượng 25(OH)D3 và LL-37 huyết thanh ở 46 trẻ bị NKTN do vi khuẩn E.coli vì trong nghiên cứu E.coli là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu thường gặp nhất.
3.2.1. Nồng độ 25(OH)D3 huyết thanh
3.2.1.1. Nồng độ 25(OH)D3 nhóm nghiên cứu Bảng 3.6: So sánh nồng độ 25(OH)D3 nhóm bệnh và nhóm chứng Bệnh Chứng n X ± SD (ng/mL) n X ± SD (ng/mL) p Nam 27 12.4 ± 5.8 22 22.6±10.3 < 0.05 Nữ 19 12.0 ±6.3 14 23.5± 9.6 < 0.05 Chung 46 12.3 ± 5.9 36 22.9 ±9.9 <0.05
Nhận xét:
Nồng độ 25(OH)D3 nhóm chứng cao hơn nhóm bệnh (p<0.05).
Nồng độ 25(OH)D3 ở cả trẻ trai và gái trong nhóm chứng đều cao hơn so với nhóm bị bệnh (p<0.05).
Sự khác biệt về nồng độ 25(OH)D3 theo giới tính ở cả hai nhóm nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.2.1.2. Phân bố nồng độ 25(OH) D3 theo nhóm tuổi
Bảng 3.7 : So sánh nồng độ 25(OH)D3 theo nhóm tuổi Bệnh Chứng n (ng/mL) X ± SD n (ng/mL) X ± SD p < 2 tuổi 25 12.4 ± 6.1 20 24 ± 9.9 < 0.05 ≥ 2 tuổi 21 12.2 ± 5.8 16 21.7± 10.1 < 0.05 Nhận xét: Nồng độ 25(OH)D3 ở nhóm bị bệnh dưới 2 tuổi và nhóm trẻ lớn đều thấp hơn nhóm không bị bệnh (p<0.05). Không có sự khác biệt nồng độ 25(OH)D3 giữa các nhóm tuổi cả 2 nhóm nghiên cứu.
3.2.1.3.Tình trạng thiếu vitamin D huyết thanh ở hai nhóm nghiên cứu. Bảng 3.8. Tình trạng dinh dưỡng vitamin D
Nhóm bệnh Nhóm chứng 25(OH)D3
n % n %
Thiếu 46 100 9 25
Nhận xét:
100% số bệnh nhi bị NKTN thiếu vitamin D (nồng độ 25(OH)D3 < 30ng/mL).
75% số trẻ không bị NKTN thiếu vitamin D (nồng độ 25(OH)D3 < 30ng/mL). 3.2.2. Nồng độ LL-37 huyết thanh 3.2.2.1. Nồng độ LL-37 nhóm trẻ NKTN và nhóm không bị bệnh Bảng 3.9. So sánh nồng độ LL-37 ở hai nhóm nghiên cứu Bệnh Chứng n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL p Nam 27 15,8 ±4 ,4 22 21,8 ± 5,5 < 0.05 Nữ 19 16,7 ± 6,1 14 17,8 ± 5,7 >0.05 Chung 46 16,2 ± 5,1 36 20,3 ± 5,9 >0.05 Nhận xét:
Nồng độ LL-37 nhóm trẻ trai trong nhóm chứng cao hơn trẻ trai bị
NKTN (p<0.05).
Xét chung nồng độ LL-37 ở nhóm chứng cao hơn nhóm trẻ bị NKTN. Nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
Không có sự khác biệt về nồng độ LL-37 theo giới tính ở cả hai nhóm nghiên cứu (p>0.05).
3.2.2.2. Phân bố nồng độ LL-37 huyết thanh theo nhóm tuổi Bảng 3.10. So sánh nồng độ LL-37 theo nhóm tuổi Bệnh Chứng n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL p < 2 tuổi 25 15.7 ± 4.3 20 19.2± 5.04 > 0.05 ≥ 2 tuổi 21 16.7 ± 6.1 16 21.56 ± 6.73 > 0.05 Nhận xét: Không có sự khác biệt nồng độ LL-37 giữa các nhóm tuổi
3.2.3. Nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 huyết thanh ở nhóm NKTN trên và NKTN dưới NKTN dưới
Bảng 3.11. So sánh nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 theo vị trí nhiễm khuẩn
NKTN trên NKTN dưới n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL p 25(OH)D3 17 36.4±17.5 29 27.2±12.1 >0.05 LL-37 17 17.3±5.9 29 15.5±4.7 >0.05 ơNhận xét:
Nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 ở các bệnh nhi NKTN trên và dưới khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.3. Liên quan nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 huyết thanh. 3.3.1. Nhóm chứng 3.3.1. Nhóm chứng