3.6.1. Quy trình thu nhận enzyme[9]
3.6.2. Thuyết minh quy trình
- Tôm hùm xanh được bắt từ lồng nuôi mang về phòng thí nghiệm trong trạng thái còn sống.
- Gây mê
+ Tôm hùm còn sống nên rất khó lấy nội tạng vì thế cần phải gây mê tôm hùm trước khi lấy nội tạng.
+ Mục đích của việc gây mê nhằm làm cho con tôm bị tê liệt hoàn toàn tạo thuận lợi cho quá trình lấy nội tạng một cách dễ dàng và không làm ảnh hưởng đến enzyme. + Tiến hành gây mê bằng cách cho con tôm vào chậu nước đá đã chuẩn bị trước đó khoảng 30 giây đến 1 phút tùy theo thể trạng của con tôm cho đến khi con tôm vừa ngưng cử động là được. Gây mê Nghiền nhỏ Trích ly Ly tâm lần một Lấy nội tạng Kết tủa Ly tâm lần hai Tôm hùm Chế phẩm enzyme
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.2. Gây mê tôm
Hình 3.3. Tôm sau gây mê
- Lấy nội tạng
+ Tôm sau khi gây mê sẽ được lấy nội tạng.
+ Nội tạng ôm được lấy bằng cách dung kéo cắt lớp vỏ dọc theo đỉnh đầu rồi lấy hết phần nội tạng bên trong, sau đó dung kéo tiếp tục cắt lớp vỏ dọc sóng lưng rồi lấy phần ruột. Tránh để mũi kéo phạm vào phần nội tạng nhằm tránh thất thoát enzyme. Tất cả phần nội tạng vừa thu được gồm dạ dày, gan tụy và đường ruột được cho vào cốc rồi đem đi định lượng.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.4. Lấy nội tạng tôm
Hình 3.5. Nội tạng tôm thu được
- Nghiền nhỏ
+ Nội tạng sau khi định lượng được cho vào cối đá (cối đá và chày nghiền phải được rửa sạch bằng nước cất và được làm lạnh bằng đá) và được nghiền nhỏ.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.6. Nghiền nội tạng
- Trích ly
+ Nội tạng sau khi nghiền nhỏ được cho vào cốc thủy tinh sạch sau đó cho đệm Tris-HCl 0,05M; pH=7 vào cốc chứa nội tạng với tỉ lệ nội tạng : đệm là 1:7. Sau đó mang đi khuấy từ trong 60 phút nhằm trích ly tối đa lượng enzyme có trong nội tạng.
+ Lưu ý:
Đệm Tris-HCl trước khi bổ sung vào dịch nội tạng cần phải được làm lạnh.
Trong quá trình khuấy phải tạo điều kiện lạnh bằng cách cho cốc đựng nội tạng vào cốc thủy tinh lớn hơn có bỏ đá nhằm tránh làm ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Ly tâm lần 1
+ Dung dịch sau trích ly được cho vào các ống ly tâm với lượng giống nhau, sau đó tiến hành ly tâm trong 15 phút với tốc độ 6000v/p ở nhiệt độ 40C bằng máy ly tâm lạnh.
+ Ly tâm lần một nhằm loại bỏ cặn của nội tạng vì thế cuối quá trình ly tâm một sẽ lấy dịch và bỏ cặn.
- Kết tủa
+ Sau quá trình ly tâm một thu được dịch, ta tiến hành kết tủa enzyme bằng cách cho dung dịch cồn 960 vào các ống ly tâm với tỷ lệ dịch enzyme : dung dịch cồn 960 là 1:6, tiến hành kết tủa trong 60 phút.
+ Lưu ý:
Cồn trước khi cho vào dịch enzyme cũng phải được làm lạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong quá trình kết tủa các ống ly tâm vào xô chứa đá nhằm tránh sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme.
Hình 3.8. Kết tủa dịch enzyme
- Ly tâm lần 2
+ Được tiến hành với điều kiện tương tự ly tâm lần một nhưng sau ly tâm sẽ tiến hành bỏ dịch và lấy tủa, tủa thu được chính là chế phẩm enzyme thô.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.9. Tủa enzyme thu được sau ly tâm lần hai
- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu được bảo quản trong tủ đông -200C nhằm giữ hoạt tính enzyme được nguyên vẹn nhất có thể.
3.7. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Định lượng protein theo phương pháp Lowry (1951) (xem phần 3.1 của phụ lục 3)
3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase
Khảo sát hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel (xem phần 3.2 của phụ lục 3)
3.9. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính amylase 3.9.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase[33]
CPE được hòa cùng nước cất sau đó tiến hành xác định hoạt tính amylase khi ủ với tinh bột 1%, pH=6 trong 30 phút ở dãy nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase[33]
Tiến hành ủ CPE đã pha loãng bằng nước cất với tinh bột 1% ở các pH sau 4, 5, 6, 7, 8 trong 30 phút ở nhiệt độ thích hợp (nhiệt độ đã rút ra ở trên). Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
300C
Ủ với tinh bột 1%, pH=6, trong 30 phút với các nhiệt độ
700C 400C 500C 600C
Kết luận về nhiệt độ hoạt động Xác định hoạt tính amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.3. Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính amylase[33]
Tiến hành ủ CPE đã pha loãng bằng nước cất với tinh bột 1% ở pH và nhiệt độ thích hợp trong 30 phút có bổ sung các muối chứa ion kim loại sau Ca2+, Hg2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+. Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
4
Ủ với tinh bột 1%, nhiệt độ thích hợp, trong 30 phút với các pH
8
5 6 7
Kết luận về pH hoạt động Xác định hoạt tính amylase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.4. Độ bền nhiệt của amylase[17]
Để tiến hành thí nghiệm, CPE được pha loãng bằng nước cất sau đó tiến hành ủ không cơ chất ở các nhiệt độ 600C, 700C, 800C, 900C trong 30 phút sau đó đưa nhanh về ủ với tinh bột 1% ở nhiệt độ tối ưu. Xác định độ bền nhiệt của amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
Ca2+
Ủ với tinh bột 1%, nhiệt độ và pH thích hợp, trong 30 phút với các ion
Zn2+
Hg2+ Mg2+ Cu2+
Kết luận về ảnh hưởng của các ion kim loại
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG CPE của nội tạng tôm
600C
Ủ không cơ chất trong 30 phút ở các nhiệt độ sau
700C 800C 900C
Xác định hoạt tính amylase Ủ có cơ chất ở nhiệt độ tối ưu trong
30 phút
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng đường chuẩn 4.1.1. Đường chuẩn albumin 4.1.1. Đường chuẩn albumin
Cần thiết phải xây dựng đường chuẩn albumin để xác định hàm lượng protein tan trong dịch enzyme pha loãng. Với chất chuẩn là dung dịch albumin, xây dựng đường chuẩn với các nồng độ lần lượt là 0; 0,02; 0,04; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4(mg/ml). Kết quả dựng đường chuẩn được thể hiện ở bảng 1.1 phụ lục 1 và hình 4.1 và 4.2 dưới đây.
Hình 4.1. Đường chuẩn albumin
0.12430.1776 0.2953 0.3915 0.491 0.637 0.784 y = 1.7272x + 0.1157 R² = 0.9929 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ∆ O D Nồng độ X(mg/ml) ΔOD ΔOD Linear (ΔOD)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.2. Thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin
4.1.2. Đường chuẩn iod
Đường chuẩn iod để hỗ trợ cho việc xác định hoạt tính enzyme amylase theo phương pháp Heikel. Nồng độ của dung dịch tinh bột lần lượt là 0, 2, 4, 6, 8, 10(mg/ml). Kết quả dựng đường chuẩn được thể hiện ở bảng 1.2 phụ lục 1 và hình 4.3 dưới đây.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.3. Đường chuẩn iod 4.2. Hàm lượng protein trong mẫu
Hàm lượng protein trong mẫu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.4 bên dưới.
Bảng 4.1. Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu
Ống nghiệm Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm 1 Mẫu thí nghiệm 2 Mẫu thí nghiệm 3 OD 0,08 3,44 3,57 3,45 OD 0 3,36 3,49 3,38 Hàm lượng protein X (mg/ml) 0 1,88 1,96 1,89 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ bảng 4.1 ở trên và phần 3.1.5 của phụ lục 3 rút ra kết luận hàm lượng protein trong mẫu được tính như sau:
Xmẫu=(Xmẫu1+Xmẫu2+Xmẫu3)/3=(1,88+1,96+1,89)/3=1,91(mg/ml). 0 0.33 0.697 0.9953 1.2411 1.4465 y = 0.1466x + 0.0518 R² = 0.9896 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 2 4 6 8 10 12 ∆ O D Nồng độ X(mg/ml) ∆OD ∆OD Linear (∆OD)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.4. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong mẫu 4.3. Khảo sát hoạt tính của amylase
4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của amylase được thể hiện ở bảng 2.1 phụ lục 2, hình 4.5 và hình 4.6 dưới đây.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase
- Kết luận: Enzyme amylase của tôm hùm xanh hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 500C. - Nhận xét: Nhìn vào đồ thị ta có thể nhận thấy:
+ Từ 300C lên 400C thì hoạt tính của amylase tăng nhẹ, chỉ tăng được 1,04(U/ml).
+ Từ 400C lên 500C thì hoạt tính của amylase tăng mạnh từ 5,84(U/ml) lên 7,93(U/ml).
+ Từ 500C lên 700C thì hoạt tính amylase giảm dần, cụ thể từ 500C lên 600C thì hoạt tính amylase giảm nhẹ, chỉ giảm 0,5(U/ml) và từ 600C đến 700C thì hoạt tính của amylase giảm rất mạnh, giảm đến 5,69(U/ml).
+ Nếu lấy hoạt tính amylase ở 500C là 100% thì hoạt tính tương đối ở 300C là 60,53%; ở 400C là 73,64%; ở 600C là 93,69%; ở 700C là 21,94%.
- Giải thích: Ở nhiệt độ thấp từ 0-400C thì hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng và đạt hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ tối ưu đối với amylase thì nhiệt độ tối ưu là 500C và ở các nhiệt độ cao sau đó thì hoạt tính enzyme giảm do sự biến tính enzyme
4.8b 5.84b 7.93c 7.43c 1.74a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 30 40 50 60 70 H TA ( U /m l) Nhiệt độ (oC) HTA (U/ml)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG bởi nhiệt độ cao. Kết quả này giống với nghiên cứu Comparative study of amylase
from the midgut gland of three species of penaeid shrimp được nêu ở tài liệu [32].
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase
Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase được thể hiện ở bảng 2.2 phụ lục 2 và hình 4.7 dưới đây.
Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase
- Kết luận: Enzyme amylase của tôm hùm xanh hoạt động ở pH tối ưu là 6. - Nhận xét: Nhìn vào đồ thị ta có thể nhận thấy
+ Ở pH=4 thì hoạt tính cuả amylase rất thấp chỉ đạt 2,22 (U/ml) nhưng tăng mạnh khi pH=5 khi đó hoạt tính đạt 5,51(U/ml) tăng 3,29 (U/ml).
+ Từ pH=5 lên pH=6 thì hoạt tính amylase tăng nhẹ từ 5,51(U/ml) ở pH=5 lên 5,71(U/ml) ở pH=6, chỉ tăng 0,2(U/ml).
+ Từ pH=6 đến pH=8 thì hoạt tính amylase giảm mạnh và đều cụ thể từ pH=6 đến pH=7 giảm 1,47(U/ml), từ pH=7 đến pH=8 giảm 2,47(U/ml).
2.22a 5.51c 5.71c 4.24b 1.77a 0 1 2 3 4 5 6 7 4 5 6 7 8 H TA ( U /m l) pH HTA (U/ml)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG + Nếu lấy hoạt tính amylase ở pH=6 là 100% thì hoạt tính amylase tương đối ở pH=4 là 38,88%; ở pH=5 là 96,5%; ở pH=7 là 74,26%; ở pH=8 là 31%. - Giải thích: Enzyme amylase đạt hoạt tính cao nhất ở pH=6 vì đây là điểm pH hoạt động tốt của amylase còn ở các mức pH còn lại làm hoạt tính của amylase giảm vì xảy ra sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme-cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy chuỗi polypeptide của enzyme.
4.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính amylase
Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính của amylase được thể hiện ở bảng 2.3; bảng 2.4 của phụ lục 2 và hình 4.8; hình 4.9 dưới đây.
Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II (1mM) đến hoạt tính amylase 100d 124.03e 2.6a 36.36c 17.57b 29.87c 0 20 40 60 80 100 120 140 160 B Ca2+ Hg2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ H T A t ư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ạ i) Ion kl hóa trị II (1mM)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.9. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II (5mM) đến hoạt tính amylase
- Kết luận: Ion Ca2+ ở 1mM kích thích hoạt tính của amylase và ức chế hoạt tính amylase ở 5mM. Còn đối với các ion kim loại còn lại thì ức chế hoạt tính của amylase ở cả hai nồng độ.
- Nhận xét: Dựa vào hai đồ thị ta thấy
+ Ở 1mM thì Ca2+ làm hoạt tính amylase tăng cao hơn so với bình thường, tăng 24,03%. Còn ở 5mM thì Ca2+ làm giảm hoạt tính của amylase, so với bình thường giảm 61,72%.
+ Đối với Hg2+ thì ở hai nồng độ đều kìm hãm hoạt động của amylase rất mạnh cụ thể ở nồng độ 1mM làm hoạt tính amylase giảm 97,4%; còn ở nồng độ 5mM thì giảm 97,66% so với bình thường.
+ Cu2+ là ion kìm hãm hoạt tính của amylase mạnh thứ hai sau Hg2+ cụ thể ở 1mM làm hoạt tính amylase giảm 82,43% còn ở 5mM thì giảm 83,59% so với bình thường. 100e 38.28d 2.34a 24.22c 16.41b 32.82d 0 20 40 60 80 100 120 B Ca2+ Hg2+ Zn2+ Cu2+ Mg2+ H T A t ư ơ n g đ ố i (% s o v ớ i c ự c đ ạ i)
Ion kim loại hóa trị II (5mM)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG + Đối với Zn2+ và Mg2+ thì mức độ kìm hãm gần như đều nhau, so với Hg2+ thì mức độ kìm hãm của Zn2+ và Mg2+ nhẹ hơn cụ thể Zn2+ ở 1mM làm hoạt tính amylase giảm 63,64% và ở 5mM thì giảm 75,78% còn Mg2+ thì ở 1mM làm hoạt tính amylase giảm 70,13% và ở 5mM thì giảm 67,18% so với bình thường. - Giải thích: Theo như đã trình bày ở mục 2.4.2 thì Ca2+ là một thành phần của α- amylase nó tham gia vào việc ổn định cấu trúc bậc 3 của α-amylase, duy trì hoạt động của α-amylase nên ở nồng độ 1mM Ca2+ có thể được xem như chất hoạt hóa của α-amylase, ở nồng độ 5mM thì Ca2+ lại ức chế hoạt động vì theo như đã trình bày ở mục 2.2.3 có nêu mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá ngưỡng nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Đối với các ion còn lại thì ức chế ở mọi nồng độ vì đây là những ion kim loại nặng làm giảm hoạt tính của amylase trong đó làm giảm mạnh nhất là Hg2+ và Cu2+. Kết quả này giống với nghiên cứu Comparative study of amylase from the midgut gland of three species of penaeid shrimp được nêu
ở tài liệu [31].
4.3.4. Độ bền nhiệt của amylase
Kết quả đánh giá độ bền nhiệt của amylase được thể hiện ở bảng 2.5 phụ lục 2 và hình 4.10 dưới đây.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.10. Đồ thị biểu diễn sự bền nhiệt của amylase
- Kết luận: Nhiệt độ càng tăng cao thì độ bền nhiệt của amylase càng giảm. - Nhật xét: Nhìn vào đồ thị ta có thể nhận thấy
+ Ở 600C hoạt tính amylase giảm 21,44% so với ở nhiệt độ tối ưu.