2.4.1. Giới thiệu
- Amylase là một loại enzyme rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ + H-OH RH + R’OH
- Có 6 loại amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (amylase nội bào) và exoamylase (amylase ngoại bào).
- Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia làm 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6- glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucoside) và Maylo- 1,6-glucoside. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase gôm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
2.4.2. α-Amylase Dạ dày Dạ dày Dịch dạ dày HCl Pepsinogen Tế bào vách Tế bào đỉnh Pepsin Tụy tạng Dịch tụy tạng Lipase Amylase Trypsin Chymotrypsin Aminopeptidase Carboxypeptidase +
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 2.2. Cấu trúc không gian của α-amylase
(nguồn http://mrc-Imb.cam.ac.vk/α-amylase)
- α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên nhưng tốc độ chậm.
- Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là một quá trình đa giai đoạn:
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose một).
+ Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo và bị phân giải chậm đến maltotetrase và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,4- glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
- Thông thường trong khoảng thời gian ngắn 30-60 phút α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay dịch hóa.
- α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này sẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Hg2+, Cu2+, Ag+. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Sn2+, không có ảnh hưởng mấy đến α- amylase.
- Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0.
- Độ bền nhiệt đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH=3,6 và 00C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG của vi khuẩn bị bất hoạt đến 50% trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi gần như giảm (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH=5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 00C và pH=2,5 nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác dụng nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C (Kozmina, 1991).
- Trong dung dịch đệm pH=4,7 α-amylase của Asp.oryzac rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin của nó chỉ còn 22%-29%, hoạt lực đường hóa còn 27%-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).
2.4.3. β-Amylase
Hình 2.3. Cấu trúc không gian của β-amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glucogen, polysaccharide cùng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch.
- β-Amylase không có khả năng thủy phân tinh bột sống mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột nên trong công nghệ sản xuất bia nó chỉ hoạt động ở giai đoạn đường hóa do khả năng chịu nhiệt kém.
- β-Amylase phân giải 100% amylase thành maltose, 54%-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài cùng có từ 20-26 gốc glucose nên tạo thành được 10-12 phân tử maltose. Khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside cà được gọi là β-dextrin, β- dextrin cho màu tím với iod. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Tác dụng của β- amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:
Tinh bột (glucogen) β-amylase Maltose (54%-58%) + β-dextrin (42%-46%) - Nếu cho cả α-amylase và β-amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột lại bị thủy phân tới 95%.
- β-Amylase là một albumin, tâm xúc tác của nó có chứa các nhóm –SH và nhóm – COOH cùng với vòng imilazol của gốc hitstidin. Khác với α-amylase, β-amylase không cần Ca làm bền cấu trúc.
- β-Amylase bị ức chế mạnh bởi các kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, ozon.
- β-Amylase rất dễ bị mất hoạt tính dưới tác dụng của aceton.
- pH tối thích của β-amylase là 5,1-5,7 (tối ưu là 5,7), β-amylase chịu nhiệt kém, nhiệt độ thích hợp <550C, ở 700C β-amylase bị vô hoạt. β-Amylase có nhiều trong hạt nảy mầm, không có trong vi khuẩn và nấm mốc.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
2.4.4. Glucoamylase (α-1,4 glucan-gluhydrolase)
Hình 2.4. Cấu trúc không gian của Glucoamylase
(nguồn http://globalhealingcenter.com)
- Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside và cả liên kết α-1,6- glucoside của tinh bột và các polysaccharide khác tương tự.
- Sự thủy phân cơ chất dưới tác dụng của glucoamylase được tiến hành tuần tự ở từng liên kết một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch tách dần từng phân tử glucose. Glucoamylase cũng có khả năng thủy phân tạo maltose, isomaltose, dextrin tới glucose.
- Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH=3,5-5,5. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất: glucoamylase từ A.niger là 6,5; từ A.awamoni là 7,5; từ R.delemar là 7,4. pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi tùy vào nhiệt độ và thời gian tác dụng. Glucoamylase của R.delemar có hoạt lực cao nhất ở pH=4,7-5 và nhiệt độ là 550C-600C, nhưng khi giảm xuống 400C thì pH tối thích là 4,5. Chế phẩm glucoamylase từ Endomycopis có pH tối thích rất hẹp từ 5,4-5,6 thời gian tác dụng là 30 phút. Nếu tăng thời gian lên thì pH tối thích mở rộng là 4,7-5,6.
- So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton và không được bảo vệ bởi Ca.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Phân tử lượng của glucoamylase tách từ A.niger là 57000, từ A.awamori là 62000.
2.5. Sơ lược về tinh bột[7] 2.5.1. Giới thiệu 2.5.1. Giới thiệu
- Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quang trọng tích lũy trong củ, quả, hạt (lúa: 60-80%, ngô: 65-75%, khoai tây: 12-20%...).
- Tinh bột được tổng hợp ở thực vật gồm hai thành phần chủ yếu: + Amylose tan trong nước cho phản ứng màu xanh với iod.
Amylose có cấu tạo hóa học là chuỗi dài không phân nhánh của các gốc α-D- glucose nối lại với nhau bằng liên kết α-1,4 glucozit. Phân tử amylase có trọng lượng khoảng 20.000-50.000đvC, có dạng xoắn mỗi vòng chứa 6 phân tử glucose. + Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đường đơn nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit. Amylopectin cho màu tím đỏ với iod. Trọng lượng phân tử thường là vài triệu đvC.
- Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15-25% amylase và 75-85% amylopectin.
2.5.2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase
Hình 2.5.Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase
(nguồn http://s4.zetaboards.com)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
2.6.1. Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối
- Nguyên tắc: muối có nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.
- Trong công nghiệp người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Nhược điểm của nó là tính ăn mòn rất cao. Sau này người ta thay thế bằng sodium sulfate, muối này không gây hư hỏng thiết bị nhưng tính hòa tan của nó không tốt.
- Nhiệt độ tiến hành tủa enzyme có thể là 35-400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme người ta phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này lại với nhau. Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng khoảng 20-80%.
2.6.2. Phương pháp trích ly và kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ
- Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi tương tác của enzyme sẽ tăng lên.
- Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi và một lượng lớn nước được đẩy đi. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ.
- Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực Vander Waals (giống như ở muối). Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng trong quá trình kết tủa là ít nhất.
- Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và aceton để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ thì cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3-100C. Tỷ lệ và nông độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch.
- Nhược điểm: có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do khi hằng số điện môi giảm phân tử protein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong khi các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tủa ở nhiệt độ phòng, nếu thực hiện ở nhiệt độ 4-100C không thấy xuất hiện kết tinh enzyme.
- Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính của enzyme. Do đó dung dịch sau lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp (thời gian khuấy 5-10 phút trong lúc đó nhiệt độ không quá 50C).
2.6.3. Phương pháp sử dụng pH
- Protein là chất lưỡng cực chúng có cả nhóm axit và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzym phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng axit vì thế quá trình này được gọi là quá trình kết tủa axit. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ chứ không được thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme. Như vậy, thiết bị phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzyme càng lớn, khi đó thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2.7. Các vấn đề trong xác định hoạt tính enzyme[11]
2.7.1. Một số điểm cần lưu ý khi xác định hoạt tính enzyme
- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp. Đối với những enzyme lần đầu tiên được nghiên cứu, pH trung tính và
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG nhiệt độ từ 300C-370C có thể được lựa chọn để thử nghiệm. Tuy vậy, có nhiều enzyme chỉ hoạt động ở một dải nhiệt độ và pH hẹp và không phụ thuộc vùng lựa chọn ban đầu khi đó cần có những điều chỉnh thích hợp để phát hiện và đo được hoạt độ của enzyme.
- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần lưu ý đến cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, albumin huyết thanh bò (BSA) hay một số chất khác.
- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, vì vậy phải