- Phương pháp này dựa vào quy tắc dưới tác dụng của amylase tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực của enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Bernfeld, Luff-Schoorla cải tiến, Graxianof,…
- Nguyên tắc chung là lợi dụng tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khử tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch Cu2+ tạo thành kết tủa
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG Cu2O. Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường khử.
- Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1micromol glucose.
2.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym tiêu hóa của tôm hùm
Hiện nay trong nước vẫn chưa tiến hành một nghiên cứu nào về hệ enzyme tiêu hóa của tôm hùm. Dưới đây là một số nghiên cứu liên quan trên thế giới:
- Các nhà nghiên cứu của F. Galgani và F. Nagayama (1987) đã tiến hành nghiên cứu hệ protease tiêu hoá ở tôm hùm gai Nhật Bản Panulirus japonicus, cho thấy tuyến tiêu hoá của chúng hoạt động ở pH tối ưu là 7.5 và nhiệt độ thích hợp là 60oC. Ủ dịch chiết hệ tiêu hoá tôm hùm gai ở 37 oC và pH 4 làm cho chúng bị bất hoạt không thuận nghịch sau 24 giờ.
Trypsin, collagenase, leucin aminopeptidase và cả carboxypeptidases a và b đều
được tìm thấy trong tuyến tiêu hoá của tôm hùm gai Nhật Bản. Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự hoạt động của chymotrypsin. Trọng lượng phân tử của trypsin và collagenase là 24,000.
- Năm 1994, H. Glass và J. Stark cũng đã có những nghiên cứu về hoạt động tiêu hoá protein ở tôm hùm Châu Âu Homarus gammarus (L), kết quả khi tiến hành
thuỷ phân casein với hai mẫu ly trích từ dạ dày và gan tuỵ của tôm hùm Châu Âu ở pH khác nhau thì pH tối ưu cho hoạt động phân giải này là pH 2.3 và 5.8, tương ứng với từng mẫu dịch chiết. Hai nhà khoa học cũng xác định dịch chiết từ gan tuỵ chứa endoprotease endoproteases - elastase (EC 3.4.21.36), trypsin (EC 3.4.21.4), exoproteases - leucine aminopeptidase (EC 3.4.11.1), carboxypeptidases a (EC
3.4.17.1) và carboxypeptidase b (EC 3.4.17.2), không phát hiện thấy hoạt động của chymotrypsin (EC 3.4.21.1). Các protease axít (pH tối ưu là 2.3) không phân giải N- acetyl phenylalanyl di-iodotyrosine (cơ chất đặc hiệu của pepsin) và cũng không hoạt động ở khi ức chế bởi chất kìm hãm đặc biệt của pepsin là pepstatin A.
- A. Zotos và K.D.A. Taylor (1995) đã được nghiên cứu hoạt động phân giải protein ở tôm hùm Na Uy (Nephrops norvegicus) với Quy trình ly trích cải tiến và tinh sạch
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG từng phần thu được 3 protease (gọi là protease I, II và III) từ đầu tôm hùm Na Uy bằng cách phối hợp kết tủa acetone rồi dùng sắc ký cột DEAE – Sepharose CL-6B. Tác giả sử dụng casein làm cơ chất, kết quả nghiên cứu cho thấy protease III có hoạt tính tốt nhất ở pH 8.2, trong khi protease I và II có hoạt tính ở vùng pH quá rộng. Protease III thể hiện đặc tính như một protease kiềm Zn – Serine bị ức chế mạnh hoạt tính bởi PMSF, chất ức chế trypsin đậu nành, Co2+, Mn2+ và 1-10 phenanthroline. Protease I bị ức chế mạnh bởi p-benzoquinone, iodo-acetamide, kim loại nặng (Ag+, Cu2+) và 1-10 phenanthroline và vì vậy nên có tính chất như là protease Zn-thiol. Protease II cũng bị kiềm hãm hoạt bởi các chất ức chế như protease I (nhưng phạm vi ít hơn) và cũng mang đặc tính như một protease thiol. Trọng lượng phân tử được xác định là 22.5, 45 và 45.5 kDa đối với protease I, II và III, tương ứng.
- M.V. Laycock và cs (1989) đã tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính của hệ proteinase cysteine tiêu hoá của tôm hùm Mỹ (Homarus americanus). Tác giả sử dụng kết hợp sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và lọc gel để tinh sạch hệ enzyme này. Proteinase cysteine chiếm tới 80% hoạt động phân giải protein trong khoang của gan tuỵ. Các ion kim loại nặng Hg, Cu và Ag là chất ức chế hoạt động mạnh nhất. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của proteinase tôm hùm với cơ chất là benzyloxycarbonlalanine p-nitrophenyl ester cũng đã được nghiên cứu. - Celis-Guerrero và đồng sự (2004) đã ước lượng hệ enzyme chịu trách nhiệm tiêu hoá protein trong thức ăn và xác định đặc tính của chúng ở tôm hùm đỏ (Panulirus
interruptus). Những thành phần tương tự như proteases đã được tìm thấy trong dịch
dạ dày, tuyến gan tuỵ và dịch ruột. Sử dụng cơ chất đặc biệt và chất ức chế, chúng tôi đã xác định được một vài isotrypsin và isochymotrypsin bằng sắc ký lọc gel. Hoạt tính protease được nhận thấy ở pH = 3 và giảm khi sử dụng chất ức chế pepstatin A.
- Năm 2008, E. Perera, F.J. Moyano và cs đã xác đính đặc tính của hệ enzyme tiêu hoá chính ở tôm hùm gai Panulirus argus bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp hoá sinh và điện di SDS – PAGE. Kết quả hoạt tính của protease và amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG được tìm thấy ở dịch vị trong khi esterase và lipase hoạt động mạnh hơn ở tuyến ruột. Một enzyme hoạt tính giống trypsin hoạt động mạnh ở cả hai nơi này. Tác giả cũng sử dụng các chất ức chế protease thường thấy đối với protease serin và metalloprotease để thử nghiệm. Kết quả là serine protease được chứng thực bằng zymograms là có một số enzyme giống như isotrypsin (17 – 21 kDa) và một vài enzyme thì giống với isochymotrypsin (23–38 kDa). Amylase (38–47 kDa) đã xác định ở zymograms và một dải phức tạp isoenzymes esterases không đặc hiệu đã được tìm thấy ở tuyến tiêu hoá. Nghiên cứu này cũng là cơ sở sinh hoá cho tập tính ăn uống của P. argus. Sự phân bố và đặc tính của hệ enzyme cung cấp một số hiểu biết về sự tiêu hoá thức ăn và là cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về sinh lý tiêu hoá của tôm hùm gai.
- Ponnuswamy Vijayaraghavan và cộng sự (2011) đã ly trích hệ cysteine proteinase từ gan tuỵ của tôm hùm Ấn Độ Panulirus homarus. Các enzyme này được tinh sạch bằng cách dùng ammonium sulphate làm tác nhân kết tủa, kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Enzyme này hoạt động rất mạnh ở pH 8,0 và nhiệt độ ủ tối ưu đã được tìm thấy là 600C. Nó là một cysteine protease, cả β-Mercaptoethanol và dithiothritol đều ảnh hưởng đến hoạt tính của protease này. Nghiên cứu được tiến hành để đánh giá trọng lượng phân tử của của protease biểu hiện. Bốn protease được phân tách thành các band trên gel điện di SDS-PAGE từ 27 đến 45.5 kDa. Band protease I và II (27 kDa, 29.5 kDa) thuộc nhóm cysteine và các band protein này bị xoá sạch khi thực hiện zymograpy trên gel đó với β-Mercaptoethanol và dithiothritol.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Nha Trang.
- Thời gian: đề tài tiến hành từ tháng 3/2013 đến 6/2013.
3.2. Vật liệu
- Tôm hùm xanh Panulirus homarus nuôi lồng tại vùng biển Khánh Hoà, được bắt sống và đưa về phòng thí nghiệm để thu nội tạng và ly trích enzyme nội tạng.
- Nội tạng thu gồm tuyến đường ruột, dạ dày, gan, tụy.
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của tôm hùm xanh (Panulirus homarus)
(nguồn http://animals.howstuffworks.com/marine-life/lobster-info1.html)
3.3. Hóa chất sử dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- NaCl, MgCl2, CaCl2, HgCl2, ZnCl2, CuSO4, NaOH, Na2CO3, CuSO4.5H2O, folin, axit sulfosalisilic, KI, iod.
- Đệm phosphat 0,1M tinh khiết sản xuất tại Đức, ethanol, đệm vạn năng (axit boric, axit phosphoric, axit acetic), đệm Tris-HCl.
3.4. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu (xem phần phụ lục 4)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Máy ly tâm lạnh.
- Máy đo quang phổ UV-Vis. - Máy đo pH.
- Tủ lạnh -200C. - Tủ lạnh 20C. - Máy khuấy từ.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Tìm hiểu nguyên liệu
Chọn phương pháp tách chiết enzyme
Chọn phương pháp khảo sát hoạt tính amylase
Tiến hành tách chiết enzyme theo phương pháp đã chọn
Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Khảo sát hoạt tính enzyme theo phương pháp đã chọn
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.6. Quy trình thu nhận enzyme và thuyết minh quy trình 3.6.1. Quy trình thu nhận enzyme[9] 3.6.1. Quy trình thu nhận enzyme[9]
3.6.2. Thuyết minh quy trình
- Tôm hùm xanh được bắt từ lồng nuôi mang về phòng thí nghiệm trong trạng thái còn sống.
- Gây mê
+ Tôm hùm còn sống nên rất khó lấy nội tạng vì thế cần phải gây mê tôm hùm trước khi lấy nội tạng.
+ Mục đích của việc gây mê nhằm làm cho con tôm bị tê liệt hoàn toàn tạo thuận lợi cho quá trình lấy nội tạng một cách dễ dàng và không làm ảnh hưởng đến enzyme. + Tiến hành gây mê bằng cách cho con tôm vào chậu nước đá đã chuẩn bị trước đó khoảng 30 giây đến 1 phút tùy theo thể trạng của con tôm cho đến khi con tôm vừa ngưng cử động là được. Gây mê Nghiền nhỏ Trích ly Ly tâm lần một Lấy nội tạng Kết tủa Ly tâm lần hai Tôm hùm Chế phẩm enzyme
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.2. Gây mê tôm
Hình 3.3. Tôm sau gây mê
- Lấy nội tạng
+ Tôm sau khi gây mê sẽ được lấy nội tạng.
+ Nội tạng ôm được lấy bằng cách dung kéo cắt lớp vỏ dọc theo đỉnh đầu rồi lấy hết phần nội tạng bên trong, sau đó dung kéo tiếp tục cắt lớp vỏ dọc sóng lưng rồi lấy phần ruột. Tránh để mũi kéo phạm vào phần nội tạng nhằm tránh thất thoát enzyme. Tất cả phần nội tạng vừa thu được gồm dạ dày, gan tụy và đường ruột được cho vào cốc rồi đem đi định lượng.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.4. Lấy nội tạng tôm
Hình 3.5. Nội tạng tôm thu được
- Nghiền nhỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nội tạng sau khi định lượng được cho vào cối đá (cối đá và chày nghiền phải được rửa sạch bằng nước cất và được làm lạnh bằng đá) và được nghiền nhỏ.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.6. Nghiền nội tạng
- Trích ly
+ Nội tạng sau khi nghiền nhỏ được cho vào cốc thủy tinh sạch sau đó cho đệm Tris-HCl 0,05M; pH=7 vào cốc chứa nội tạng với tỉ lệ nội tạng : đệm là 1:7. Sau đó mang đi khuấy từ trong 60 phút nhằm trích ly tối đa lượng enzyme có trong nội tạng.
+ Lưu ý:
Đệm Tris-HCl trước khi bổ sung vào dịch nội tạng cần phải được làm lạnh.
Trong quá trình khuấy phải tạo điều kiện lạnh bằng cách cho cốc đựng nội tạng vào cốc thủy tinh lớn hơn có bỏ đá nhằm tránh làm ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Ly tâm lần 1
+ Dung dịch sau trích ly được cho vào các ống ly tâm với lượng giống nhau, sau đó tiến hành ly tâm trong 15 phút với tốc độ 6000v/p ở nhiệt độ 40C bằng máy ly tâm lạnh.
+ Ly tâm lần một nhằm loại bỏ cặn của nội tạng vì thế cuối quá trình ly tâm một sẽ lấy dịch và bỏ cặn.
- Kết tủa
+ Sau quá trình ly tâm một thu được dịch, ta tiến hành kết tủa enzyme bằng cách cho dung dịch cồn 960 vào các ống ly tâm với tỷ lệ dịch enzyme : dung dịch cồn 960 là 1:6, tiến hành kết tủa trong 60 phút.
+ Lưu ý:
Cồn trước khi cho vào dịch enzyme cũng phải được làm lạnh.
Trong quá trình kết tủa các ống ly tâm vào xô chứa đá nhằm tránh sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme.
Hình 3.8. Kết tủa dịch enzyme
- Ly tâm lần 2
+ Được tiến hành với điều kiện tương tự ly tâm lần một nhưng sau ly tâm sẽ tiến hành bỏ dịch và lấy tủa, tủa thu được chính là chế phẩm enzyme thô.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 3.9. Tủa enzyme thu được sau ly tâm lần hai
- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu được bảo quản trong tủ đông -200C nhằm giữ hoạt tính enzyme được nguyên vẹn nhất có thể.
3.7. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Định lượng protein theo phương pháp Lowry (1951) (xem phần 3.1 của phụ lục 3)
3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase
Khảo sát hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel (xem phần 3.2 của phụ lục 3)
3.9. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính amylase 3.9.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase[33]
CPE được hòa cùng nước cất sau đó tiến hành xác định hoạt tính amylase khi ủ với tinh bột 1%, pH=6 trong 30 phút ở dãy nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase[33] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành ủ CPE đã pha loãng bằng nước cất với tinh bột 1% ở các pH sau 4, 5, 6, 7, 8 trong 30 phút ở nhiệt độ thích hợp (nhiệt độ đã rút ra ở trên). Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
300C
Ủ với tinh bột 1%, pH=6, trong 30 phút với các nhiệt độ
700C 400C 500C 600C
Kết luận về nhiệt độ hoạt động Xác định hoạt tính amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.3. Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính amylase[33]
Tiến hành ủ CPE đã pha loãng bằng nước cất với tinh bột 1% ở pH và nhiệt độ thích hợp trong 30 phút có bổ sung các muối chứa ion kim loại sau Ca2+, Hg2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+. Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
4
Ủ với tinh bột 1%, nhiệt độ thích hợp, trong 30 phút với các pH
8
5 6 7
Kết luận về pH hoạt động Xác định hoạt tính amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
3.9.4. Độ bền nhiệt của amylase[17]
Để tiến hành thí nghiệm, CPE được pha loãng bằng nước cất sau đó tiến hành ủ không cơ chất ở các nhiệt độ 600C, 700C, 800C, 900C trong 30 phút sau đó đưa nhanh về ủ với tinh bột 1% ở nhiệt độ tối ưu. Xác định độ bền nhiệt của amylase theo phương pháp Heikel. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE của nội tạng tôm
Ca2+
Ủ với tinh bột 1%, nhiệt độ và pH thích hợp, trong 30 phút với các ion
Zn2+
Hg2+ Mg2+ Cu2+
Kết luận về ảnh hưởng của các ion kim loại
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG CPE của nội tạng tôm
600C
Ủ không cơ chất trong 30 phút ở các nhiệt độ sau
700C 800C 900C
Xác định hoạt tính amylase Ủ có cơ chất ở nhiệt độ tối ưu trong
30 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng đường chuẩn 4.1.1. Đường chuẩn albumin 4.1.1. Đường chuẩn albumin
Cần thiết phải xây dựng đường chuẩn albumin để xác định hàm lượng protein tan trong dịch enzyme pha loãng. Với chất chuẩn là dung dịch albumin, xây dựng đường chuẩn với các nồng độ lần lượt là 0; 0,02; 0,04; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4(mg/ml). Kết quả dựng đường chuẩn được thể hiện ở bảng 1.1 phụ lục 1 và hình 4.1 và 4.2 dưới đây.
Hình 4.1. Đường chuẩn albumin
0.12430.1776 0.2953 0.3915 0.491 0.637 0.784 y = 1.7272x + 0.1157 R² = 0.9929 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ∆ O D Nồng độ X(mg/ml) ΔOD ΔOD Linear (ΔOD)
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG
Hình 4.2. Thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin
4.1.2. Đường chuẩn iod
Đường chuẩn iod để hỗ trợ cho việc xác định hoạt tính enzyme amylase theo