- Nguyên tắc: muối có nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.
- Trong công nghiệp người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Nhược điểm của nó là tính ăn mòn rất cao. Sau này người ta thay thế bằng sodium sulfate, muối này không gây hư hỏng thiết bị nhưng tính hòa tan của nó không tốt.
- Nhiệt độ tiến hành tủa enzyme có thể là 35-400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme người ta phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này lại với nhau. Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng khoảng 20-80%.
2.6.2. Phương pháp trích ly và kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ
- Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi tương tác của enzyme sẽ tăng lên.
- Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi và một lượng lớn nước được đẩy đi. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ.
- Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực Vander Waals (giống như ở muối). Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng trong quá trình kết tủa là ít nhất.
- Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và aceton để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ thì cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3-100C. Tỷ lệ và nông độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch.
- Nhược điểm: có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do khi hằng số điện môi giảm phân tử protein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong khi các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tủa ở nhiệt độ phòng, nếu thực hiện ở nhiệt độ 4-100C không thấy xuất hiện kết tinh enzyme.
- Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính của enzyme. Do đó dung dịch sau lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp (thời gian khuấy 5-10 phút trong lúc đó nhiệt độ không quá 50C).
2.6.3. Phương pháp sử dụng pH
- Protein là chất lưỡng cực chúng có cả nhóm axit và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzym phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng axit vì thế quá trình này được gọi là quá trình kết tủa axit. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ chứ không được thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme. Như vậy, thiết bị phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzyme càng lớn, khi đó thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2.7. Các vấn đề trong xác định hoạt tính enzyme[11]
2.7.1. Một số điểm cần lưu ý khi xác định hoạt tính enzyme
- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp. Đối với những enzyme lần đầu tiên được nghiên cứu, pH trung tính và
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG nhiệt độ từ 300C-370C có thể được lựa chọn để thử nghiệm. Tuy vậy, có nhiều enzyme chỉ hoạt động ở một dải nhiệt độ và pH hẹp và không phụ thuộc vùng lựa chọn ban đầu khi đó cần có những điều chỉnh thích hợp để phát hiện và đo được hoạt độ của enzyme.
- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần lưu ý đến cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, albumin huyết thanh bò (BSA) hay một số chất khác.
- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, vì vậy phải dùng đệm hay một hệ thống đệm nào đó. Nồng độ đệm thường dùng là 20-50mM. Tuy vậy với các phân tử sinh axit, base thì phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn để tránh thay đổi pH trong quá trình phân tích. Một số đệm có thể làm kết tủa một số yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+ vì vậy phải lựa chọn loại đệm thích hợp cho phân tích.
- Trong phân tích hoạt độ enzyme, cơ chất, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng. Với các phân tích đồng thời nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng của tất cả các mẫu phải được duy trì như nhau.
- Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số.
- Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp. Trong một số trường hợp, cách làm ngừng phản ứng enzyme có thể làm biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo. Trong nhiều trường hợp khác, chất làm ngừng phản ứng có thể can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng enzyme, ví dụ như chất làm ngừng phản ứng có cùng bước sóng hấp thụ ánh sáng cần đo với chất phản ứng, hay ức chế tạo màu tiếp theo của phân tích.
- Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bảo hòa enzyme nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzyme.
- Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng.
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG - Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao.
- Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5-30 phút. Trong mộ số trường hợp có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt tính của enzyme quá thấp. Trong trường hợp đó cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho vi sinh vật phát triển.
2.7.2. Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Các phản ứng do enzyme xúc tác có thể được khái quát và đơn giản hóa bằng phương trình phản ứng chung dưới đây:
E + S ES ES* E + P
Trong phương trình phản ứng trên: E là enzyme. S là cơ chất.
ES là phức chất hình thành giữa enzyme và cơ chất. ES* là phức chất giữa enzyme và cơ chất trong (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đó cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng.
P là sản phẩm của phản ứng.
Có thể xác định được hoạt độ enzyme bằng cách phân tích sự biến đổi theo thời gian trong những điều kiện phản ứng xác định của:
+ Cơ chất còn lại. + Sản phẩm tạo thành. + Cơ chất và sản phẩm.
2.8. Các phương pháp xác định hoạt tính amylase[10] 2.8.1. Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch[20] 2.8.1. Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch[20]
- Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch được đo bằng nhớt kế khi cho enzyme tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần.
- Phương pháp đo độ nhớt của Davison. Độ nhớt của dung dịch phụ thuộc vào kích thước phân tử của hệ phân tán. Khi cắt phân tử tinh bột thành những dextrin làm độ
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG nhớt của dung dịch giảm. Trong phương pháp này hoạt tính amylase được xác định là lượng enzyme làm giảm 20% độ nhớt trong 60 phút hoặc 10% trong 19,2 phút hoặc 5% trong 8,4 phút. Do đó nếu như 0,2ml dung dịch enzyme làm giảm độ nhớt ban đầu trong 20 phút thì dung dịch sẽ chứa 15 đơn vị amylase (60/(20*0,2)) trong 1ml.
2.8.2. Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iod[6]
- Khi có amylase tác dụng thì các sản phẩm thủy phân của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod.
- Phương pháp Wohlgemuth
+ Xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột dựa theo phản ứng màu với iod.
+ Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C khi có ion Cl- có thể phân giải 1mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với dung dịch I2. Biểu diễn hoạt động enzyme bằng số đơn vị trên 1ml dịch môi trường hay 1ml dung dịch chiết enzyme và từ đó quy ra theo gam chế phẩm enzyme.
- Phương pháp Heikel
+ Phương pháp xác định dựa vào lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod.
+ Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 300C.
2.8.3. Đo lượng đường khử tạo thành[6]
- Phương pháp này dựa vào quy tắc dưới tác dụng của amylase tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực của enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Bernfeld, Luff-Schoorla cải tiến, Graxianof,…
- Nguyên tắc chung là lợi dụng tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khử tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch Cu2+ tạo thành kết tủa
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG Cu2O. Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường khử.
- Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1micromol glucose.
2.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym tiêu hóa của tôm hùm
Hiện nay trong nước vẫn chưa tiến hành một nghiên cứu nào về hệ enzyme tiêu hóa của tôm hùm. Dưới đây là một số nghiên cứu liên quan trên thế giới:
- Các nhà nghiên cứu của F. Galgani và F. Nagayama (1987) đã tiến hành nghiên cứu hệ protease tiêu hoá ở tôm hùm gai Nhật Bản Panulirus japonicus, cho thấy tuyến tiêu hoá của chúng hoạt động ở pH tối ưu là 7.5 và nhiệt độ thích hợp là 60oC. Ủ dịch chiết hệ tiêu hoá tôm hùm gai ở 37 oC và pH 4 làm cho chúng bị bất hoạt không thuận nghịch sau 24 giờ.
Trypsin, collagenase, leucin aminopeptidase và cả carboxypeptidases a và b đều
được tìm thấy trong tuyến tiêu hoá của tôm hùm gai Nhật Bản. Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự hoạt động của chymotrypsin. Trọng lượng phân tử của trypsin và collagenase là 24,000.
- Năm 1994, H. Glass và J. Stark cũng đã có những nghiên cứu về hoạt động tiêu hoá protein ở tôm hùm Châu Âu Homarus gammarus (L), kết quả khi tiến hành
thuỷ phân casein với hai mẫu ly trích từ dạ dày và gan tuỵ của tôm hùm Châu Âu ở pH khác nhau thì pH tối ưu cho hoạt động phân giải này là pH 2.3 và 5.8, tương ứng với từng mẫu dịch chiết. Hai nhà khoa học cũng xác định dịch chiết từ gan tuỵ chứa endoprotease endoproteases - elastase (EC 3.4.21.36), trypsin (EC 3.4.21.4), exoproteases - leucine aminopeptidase (EC 3.4.11.1), carboxypeptidases a (EC
3.4.17.1) và carboxypeptidase b (EC 3.4.17.2), không phát hiện thấy hoạt động của chymotrypsin (EC 3.4.21.1). Các protease axít (pH tối ưu là 2.3) không phân giải N- acetyl phenylalanyl di-iodotyrosine (cơ chất đặc hiệu của pepsin) và cũng không hoạt động ở khi ức chế bởi chất kìm hãm đặc biệt của pepsin là pepstatin A.
- A. Zotos và K.D.A. Taylor (1995) đã được nghiên cứu hoạt động phân giải protein ở tôm hùm Na Uy (Nephrops norvegicus) với Quy trình ly trích cải tiến và tinh sạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG từng phần thu được 3 protease (gọi là protease I, II và III) từ đầu tôm hùm Na Uy bằng cách phối hợp kết tủa acetone rồi dùng sắc ký cột DEAE – Sepharose CL-6B. Tác giả sử dụng casein làm cơ chất, kết quả nghiên cứu cho thấy protease III có hoạt tính tốt nhất ở pH 8.2, trong khi protease I và II có hoạt tính ở vùng pH quá rộng. Protease III thể hiện đặc tính như một protease kiềm Zn – Serine bị ức chế mạnh hoạt tính bởi PMSF, chất ức chế trypsin đậu nành, Co2+, Mn2+ và 1-10 phenanthroline. Protease I bị ức chế mạnh bởi p-benzoquinone, iodo-acetamide, kim loại nặng (Ag+, Cu2+) và 1-10 phenanthroline và vì vậy nên có tính chất như là protease Zn-thiol. Protease II cũng bị kiềm hãm hoạt bởi các chất ức chế như protease I (nhưng phạm vi ít hơn) và cũng mang đặc tính như một protease thiol. Trọng lượng phân tử được xác định là 22.5, 45 và 45.5 kDa đối với protease I, II và III, tương ứng.
- M.V. Laycock và cs (1989) đã tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính của hệ proteinase cysteine tiêu hoá của tôm hùm Mỹ (Homarus americanus). Tác giả sử dụng kết hợp sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và lọc gel để tinh sạch hệ enzyme này. Proteinase cysteine chiếm tới 80% hoạt động phân giải protein trong khoang của gan tuỵ. Các ion kim loại nặng Hg, Cu và Ag là chất ức chế hoạt động mạnh nhất. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của proteinase tôm hùm với cơ chất là benzyloxycarbonlalanine p-nitrophenyl ester cũng đã được nghiên cứu. - Celis-Guerrero và đồng sự (2004) đã ước lượng hệ enzyme chịu trách nhiệm tiêu hoá protein trong thức ăn và xác định đặc tính của chúng ở tôm hùm đỏ (Panulirus
interruptus). Những thành phần tương tự như proteases đã được tìm thấy trong dịch
dạ dày, tuyến gan tuỵ và dịch ruột. Sử dụng cơ chất đặc biệt và chất ức chế, chúng tôi đã xác định được một vài isotrypsin và isochymotrypsin bằng sắc ký lọc gel. Hoạt tính protease được nhận thấy ở pH = 3 và giảm khi sử dụng chất ức chế pepstatin A.
- Năm 2008, E. Perera, F.J. Moyano và cs đã xác đính đặc tính của hệ enzyme tiêu hoá chính ở tôm hùm gai Panulirus argus bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp hoá sinh và điện di SDS – PAGE. Kết quả hoạt tính của protease và amylase
GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH SVTH: TRẦN THỊ THANH HỒNG được tìm thấy ở dịch vị trong khi esterase và lipase hoạt động mạnh hơn ở tuyến ruột. Một enzyme hoạt tính giống trypsin hoạt động mạnh ở cả hai nơi này. Tác giả cũng sử dụng các chất ức chế protease thường thấy đối với protease serin và