Là vật liệu để cốđịnh vi sinh vật lên bề mặt hay để nhốt vào. Chất mang rất đa dạng về chủng loại, nguồn gốc, tính chất và đặc tính.
2.4.3.1 Yêu cầu của chất mang
Chất mang đóng vai trò quan trọng trong ảnh hưởng đến khả năng cố định vi sinh vật. Một chất mang lý tưởng cần có những tính chất như sau:
- Bền vững, ổn định cơ lý, chịu được các điều kiện môi trường như khuấy trộn, áp lực trong quy trình sản xuất.
- Bền vững hóa học, không tan lẫn trong môi trường phản ứng.
- Chất mang không được làm mất hay không được ức chế hoạt tính enzyme của vi sinh vật.
- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với những sự tấn công của vi sinh vật.
- Có hình dạng phù hợp với thiết bị phản ứng sinh học.
- Chất mang phải được chọn lọc sao cho việc cốđịnh vi sinh vật dễ dàng. - Có thể sử dụng lại nhiều lần.
- An toàn với môi trường sống.
- Có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi sinh vật, vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờđó làm tăng hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng.
- Chất mang có thể có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…
2.4.3.2 Phân loại chất mang
Tùy vào nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu tạo mà người ta phân chia chất mang ra thành 4 loại:
a. Chất mang hữu cơ tự nhiên b. Chất mang hữu cơ tổng hợp
c. Chất mang vô cơ tự nhiên d. Chất mang vô cơ tổng hợp
Sơ đồ 2. 5 Phân loại chất mang[13]. Chất mang Chất mang vô cơ Chất mang hữu cơ
Chất mang hữu cơ tự nhiên: cellulose, CM- cellulose, DEAE- cellulose, collagen, gel agar, K-carragenan, gel alginate, chitin, chitosan.
Chất mang hữu cơ tổng hợp: polyacrylamic, polyester, polyvinylacetate,
polycrylamide, polyalcolhol.
Chất mang vô cơ tự nhiên: zeolit, than hoạt tính, cát, silicat.
Chất mang vô cơ tổng hợp: aluminum oxide, silicum oxide, sợi bông thủy tinh.
Bảng 2. 10 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang
Chất mang Ưu điểm Nhược điểm
Chất mang hữu cơ tự nhiên Nguyên liệu rẻ tiền, khá bền vững trong môi
trường nước, trương nở tốt
Cấu trúc không đồng nhất, tính bền cơ lý còn kém.
Chất mang hữu cơ tổng hợp
Bền, tính chất cơ lý tốt,
hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi sinh vật, độ trương tốt và đặc biệt có thể điều chỉnh được kích
thước chất mang để nâng cao hiệu quả cốđịnh.
Giá thành cao, sự trương
sinh học kém, khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường
Chất mang vô cơ tự nhiên Có cấu trúc lỗ xốp. Không an toàn sử dụng trong thực phẩm.
Chất mang vô cơ tổng hợp Có cấu trúc lỗ xốp và khảnăng hấp phụ tốt.
Tan trong môi trường kiềm có pH > 7.5.
[6][9]
2.4.3.3 Chất mang Bacterial cellulose a. Vi sinh vật sản sinh BC
Ngoài thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình thành nên vách tế bào, cellulose còn được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn, được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC). Con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ
yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loại mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau. Từđó tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính cũng khác nhau.
Bảng 2. 11Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật
Giống Cấu trúc cellulose
Acetobacter Lớp sợi ngoại bào tạo thành các dãy
Achromobacter Sợi Aerobacter Sợi Agrobacterium Sợi ngắn Alcaligen Sợi Pseudomonas Các sợi không tách biệt Rhizobium Sợi ngắn Sarcina Cellulose dị hình Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc [16]
b. Sơ lược về Acetobacter xylinum
Hình 2. 8 Acetobacter xylinum [46].
Acetobacter xylinum (A.aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius). Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tượng A. xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi.
Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau: Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
Loài: Acetobacter xylinum
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di
động và không sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy.
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị
biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và
môi trường khí.
Chúng không sử dụng muối NH4 làm nguồn nitơ duy nhất, đồng thời trên bề
mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose. Ngoài ra, A. xylinum tạo: phản ứng catalase dương tính, oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, tổng hợp cellulose.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị. Nhiệt độ
tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 30oC và pH từ 5.4 đến 6.3. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5.5 và chúng không phát triển ở nhiệt độ 37oC ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu.
Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [7].
c. Đặc điểm của BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy, BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình
thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1.5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ
Bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay
đổi từ 1 – 9 µm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen.
BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ polymer hóa từ 2.000 – 6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000, trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000. So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn,
thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn
[12][16]. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là
BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗđược xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi
trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống
đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từmôi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC: Agitated-BC). A- BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau trong môi
trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cảhai hướng song song và vuông góc [12][16]. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscope). Những sợi S - BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau.
Những sợi A-BC thì rối rắm và cong (hình 2.2). Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A- BC (0.1- 0.2µm) lớn hơn sợi S-BC (0.05 – 0.10µm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [12][14].
Hình 2. 9 A-BC được tạo ra từmôi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh (b) [30].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại. Cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I.
Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4- glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo một trục. Trong khi đó, các chuỗi β-1,4- glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu nhiên, hầu
như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp cellulose II. A. xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II [16][17].
Trong phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do được cấu tạo bởi glucose dạng α hay dạng β. Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn [17]. Glucose dạng α
và glucose dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ khác nhau ở sự định hướng của nhóm hydroxyl. Hai dạng này có ở các cellulose có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn, thực vật. BC có dạng Iα nhiều hơn PC.
S-BC có nhiều dạng Iαhơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. A- BC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏhơn S-BC [12][16].
Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên, cellulose II chỉđược tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn như Sarcina ventriculi, A. xylinum). Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có được là dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật [16].
Hình 2. 10 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của thực vật (x200) [56].
d. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo BC
Ảnh hưởng bởi phương pháp lên men
Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để
thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau.
Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi
trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của
A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam.
Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế
bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương pháp
tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến Cel một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel- này sẽ không còn khả năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể sau đó.
Ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH, oxy
- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh cellulose là 25- 30oC, có tác giả lại cho là từ 28- 30oC
- Ảnh hưởng của pH
Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4 – 7. Theo Hestrin và Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả. Còn Fiedler và cộng sự thì cho pH = 5 – 7 thì tối ưu. Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các nghiên cứu.
Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH = 4 – 4.5 thì cho kết quả ưu thế hơn
do giảm sự tạp nhiễm. A.xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại: enzyme cellulase và bacterial cellulose. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế độ pH của môi trường dinh dưỡng
để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại này. Khi pH ở mức từ 4 – 4.5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở mức từ 5 – 5.5 thì lượng enzyme cellulase
được sản sinh cao hơn.
Theo S. Hestrin và M. Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để điều chỉnh pH môi trường.
- Ảnh hưởng của oxy
Nồng độ O2 liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC. Khi không khí giàu O2 (duy trì nồng độ O2 lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi nuôi cấy thì sản lượng BC tăng lên 1.5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên đến 18%. Tuy nhiên, với nồng độ O2 như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu nuôi cấy thì sốlượng tế
Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện nồng độ O2 hòa tan cao (vì trong
điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn). Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O2 10% và 15% một vài chủng A. xylinum cho sản lượng BC cao hơn ở nồng độ O2 là 20%. Khi nồng độ O2 tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng kể sản lượng BC trong khi sự
tăng trưởng của tế bào vẫn tiếp tục duy trì.
Ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng
- Ảnh hưởng do nguồn cacbon
Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose, sorbitol và manitol. Glycerol, galactose, lactose, sucrose và maltose được xem là cơ
chất thích hợp. Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate. Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất khả năng sản sinh BC.
- Ảnh hưởng do nguồn nitrogen
Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0.5% cao nấm men và 0.5% pepton. Đối với một số dòng A. xylinum lại cho thêm tryptophan, dịch chiết ngô
vào trong môi trường. Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả hơn cả. Các acid amin