Ngày nay, sản phẩm rượu vang đã trở nên rất phổ biến và được nhiều người ưa
chuộng trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Vì vậy mà ngành công nghiệp sản xuất
rượu vang cũng rất phát triển và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc nghiên cứu
để hoàn thiện chất lượng, mùi vị cũng như đa dạng hóa các sản phẩm rượu vang.
Trong nước, ngành công nghiệp sản xuất thức uống đang ngày càng phát triển
với nhiều chủng loại khác nhau. Trong đó, các loại thức uống từ trái cây đang là xu
hướng phổ biến, đặc biệt là sản phẩm rượu. Ngày nay, nguồn nguyên liệu để sản xuất rượu không chỉ đơn thuần đi từ nho mà còn mở rộng ra từ các loại trái cây khác như
dâu tằm, dưa hấu,thanh long, điều…
Trên thịtrường hiện nay chưa có những dòng sản phẩm rượu chanh dây
mà nước uống từ chanh dây chủ yếu là các sản phẩm rượu mùi. Nhận thấy được những
trường đại học đã có nhiều đề tài nghiên cứu để sản xuất thức uống lên men từ chanh dây và đã thu được những kết quả khả quan. Bên cạnh đó còn có đề tài của Giảng viên Nguyễn Thị Thu Sang và các cộng sự thuộc Trường ĐH Bán công Tôn Đức Thắng (TP HCM) đã thành công trong việc sản xuất một loại rượu vang mới được chiết xuất
từ vỏ trái chanh dây. Đề tài đã tận dụng nguồn vỏ chanh dây được thải ra từ các xí nghiệp, cơ sở chế biến nước ép trái cây, nhóm nghiên cứu đã ứng dụng phương pháp lên men rượu vang để sản xuất rượu. Nguồn vỏ chanh dây bị thải ra này được làm sạch, xử lý bằng chế phẩm enzyme nên vừa không gây hại cho môi trường, lại tạo ra
chất lượng rượu vang không tổn hại cho sức khỏe. Theo đó, loại rượu vang này có mùi thơm đặc trưng của trái chanh dây Việt Nam, giá thành rẻ (dự kiến là rẻ hơn
30% so với giá rượu vang Đà Lạt) và chỉ cao hơn nồng độ bia một ít. Rượu vang thành phẩm được chiết xuất từ vỏ trái chanh dây này còn có giá trị cao về mặt y học, chứa
hợp chất tannin nên có khả năng ngừa được ung thư phổi và một số bệnh lý khác.
Việc lên men rượu sử dụng tế bào nấm men cố định cũng đã được nghiên cứu
nhiều. Bên cạnh những chất mang đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều như gel aginate natri thì một số nhà nghiên cứu cũng đã tìm ra một số chất mang mới.
Năm 2008, nhóm các tác giả Nikolaos Agouridis, Nikolaos Kopsahelis, Stavros Plessas, Athanasios A. Koutinas, Maria Kanellaki đã thực hiện việc cố định vi khuẩn
Oenococcus oeni trên vật liệu dẫn xuất của cellulose vi khuẩn (delignified cellulosic material) (DCM) để lên men malolactic trong rượu. Các tác giả đã cố định chủng
Oenococcus oeni ATCC 23279 trên DCM để sử dụng trong quá trình lên men malolactic. Đầu tiên, họ lên men theo mẻ rượu và lặp lại 11 lần bằng chế phẩm
Saccharomyces cerevisiae cố định trên DCM ở 20oC sao cho sản phẩm có độ cồn trong khoảng 11 – 12o. Sau đó tiến hành lên men malolactic bằng chế phẩm
Oenococcus oeni cố định trên DCM ở 27oC. Kết quả cho thấy rằng, khi lên men malolactic từ lần thứ3 đến lần thứ 10 thì lượng acid malic giảm từ53.1 đến 67.4% và mật độ tế bào cốđịnh/g DCM duy trì không đổi.
Ngoài ra, acid lactic tăng lên, acid acetic giảm xuống và các cấu tử hương trong rượu cũng được tăng lên làm cải thiện đáng kể mùi vị của rượu. Nồng độ ethanol cao hơn,
nồng độ acetaldehyde và diacetyl trong rượu sau quá trình lên men malolactic đều ở
Gần đây, các nhà khoa học đã tái tổ hợp thành công một chủng nấm men thuộc loài S.cerevisiae là ML01, mang đặc tính di truyền của cả Schizosaccharomyces pombe (gen mae1) và Oenococcus oeni (gen mleA). ML01 có khả năng chuyển hóa hoàn toàn 5,5 g/l malata trong dịch lên men vang Chardonnay khi quá trình lên men
rượu kết thúc (John I. Husnik, 2007). Chủng nấm men này được tổ chứa FDA (Food & Drug Administration) tuyên bố là rất an toàn khi sử dụng vì chúng không có khảnăng
sinh ra các amine có hoạt tính sinh học (biogenic amines) như vi khuẩn lactic trong vang. Tuyên bố này đã đem lại triển vọng rất lớn đối với công nghiệp sản xuất rượu vang. Với tất cả những ưu điểm vượt trội của mình, ML01 được xem là chủng nấm
men đột biến đầu tiên có khảnăng được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu vang [26].
Sử dụng SO2 chỉ là cách thức để điều khiển và ức chế sự phát triển của vi khuẩn
trong rượu. Tuy nhiên SO2 cũng là mối đe dọa đối với sức khỏe của con người, vì thế
mà người ta yêu cầu phải ghi nồng độ SO2 sử dụng lên nhãn của vỏ chai. Đó cũng là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nguyên nhân dẫn tới việc nghiên cứu để tìm ra các hợp chất thay thế. Bacteriocins là những peptid kháng khuẩn hay protein được tổng hợp trên ribosom của vi khuẩn. Chúng thể hiện độc tính cao đối với những sinh vật khác, cụ thể là những chủng liên quan chặt chẽ tới sinh vật sản xuất. Hiện tượng này đã gây nên một sự cạnh tranh
trong cơ thể sinh vật. Chúng không mùi, không màu và không độc hại đối với con
người. Một số loại bacteriocins đã được tìm thấy như nisin và pediocin PD-1 và Schoeman và cộng sựđã chuyển gen này vào nấm men S.cerevisiae. Chủng nấm men này mang những bacteriocin hữu ích trong rượu vang, có thểđiều khiển quá trình lên men malolactic hoặc ức chế chủng LAB không mong muốn. Theo Bauer, những chất
ức chế tự nhiên có thể sẽ là chiến lược để cải thiện chất lượng sản phẩm, tạo ra những sản phẩm có chất lượng tốt và an toàn là mục tiêu nghiên cứu trong tương lai [21].
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu
3.1.1 Chanh dây
Nguyên liệu chính sử dụng trong đề tài là loại chanh dây màu tím có nguồn gốc từĐà Lạt – Lâm Đồng. Quả chín, mọng nước, có mùi thơm đặc trưng.
3.1.2 Giống vi sinh vật
Đề tài sử dụng 3 giống là Saccharomyces cerevisiae N28, Oenococcus oeni, Acetobacter xylinum BC 16 thuần chủng có nguồn gốc từ bộsưu tập giống của phòng thí nghiệm vi sinh – Bộ môn Công nghệ sinh học – Khoa Kỹ thuật hóa học – Đại học Bách khoa TP. HCM cung cấp.
3.1.3 Môi trường nuôi cấy
3.1.3.1 Saccharomyces cerevisiae
Môi trường giữ giống (MT1) là môi trường Hansen với các thành phần như sau:
Bảng 3. 1 Thành phần môi trường Hansen Thành phần Nồng độ (g/l) Glucose 50 K2HPO4 3 Peptone 10 MgSO4.7H2O 3 Agar 20 Nước 1lit
Môi trường nhân giống (MT2) với các thành phần tương tự như môi trường
3.1.3.2 Oenococcus oeni
Môi trường giữ giống (MT3) là môi trường MLA với các thành phần như sau:
Bảng 3. 2 Thành phần môi trường MLA
Thành phần Nồng độ (g/l) Tryptone 10 Glucose 2.5 Sucrose 100 Cao nấm men 5 Natri citrate 10 Agar 20 Nước 1lit
Môi trường nhân giống (MT4) với các thành phần tương tựnhư môi trường
MT3 nhưng không có agar.
3.1.3.3 Acetobacter xylinum
Môi trường giữ giống (MT5) với các thành phần như sau:
Bảng 3. 3 Thành phần môi trường MT5 Thành phần Nồng độ (g/l) (NH4)2SO4 8 (NH4)2HPO4 2 Glucose 20 Agar 20
Nước dừa già 1 lit
Môi trường nhân giống (MT6) với các thành phần như sau: Bảng 3. 4 Thành phần môi trường MT6 Thành phần Nồng độ (g/l) (NH4)2SO4 8 (NH4)2HPO4 2 Glucose 20
Nước dừa già 1lit
Acid acetic
(Được chỉnh pH: 4-4.5)
5 ml/l
Môi trường lên men (MT7) với các thành phần tương tự như môi trường nhân giống (MT6) nhưng môi trường MT6 được thanh trùng ở 100oC trong vài phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.4 Vật liệu, hóa chất
Vật liệu: BC được sản xuất từ quá trình lên men Acetobacter xylinum trong môi
trường nước dừa già theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trong 7 ngày.
Hóa chất: ngoài các hóa chất có trong thành phần môi trường như đã liệt kê ở trên, đề tài còn sử dụng một số hóa chất khác như NaOH, CaCO3, acid citric, thuốc thử
phenol phtalein, thuốc nhuộm Gram, nước cất.
3.1.5 Thiết bị và dụng cụ
Bên cạnh các dụng cụ thí nghiệm cơ bản như que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, erlen, bình định mức, ống đong, đèn cồn, đũa khuấy… đề tài còn sử dụng một số thiết bịđể nuôi cấy và phân tích: tủ cấy vô trùng, tủ sấy, máy lắc, máy khuấy từ, nồi hấp tiệt trùng, tủ lạnh, kính hiển vi, khúc xạ kế, pH kế, bình tỷ trọng, máy Vortex, máy đo OD, máy chưng cất cồn, buồng đếm hồng cầu, cân 2 số, cân 4 số, bơm chân không, phễu lọc Bucher…
3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cảm quan Chanh dây Saccharomyces cerevisiae Acetobacter xylinum Oenococcus oeni Lọc Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1 Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển
Lên men rượu
Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2
Lên men thu BC
Xử lí BC
Khảo sát CĐ bằng pp nhốt
Khảo sát CĐ bằng pp bẫy-hấp phụ
Khảo sát lên men malolactic bằng vi
khuẩn tự do
Lên men malolactic bằng vi khuẩn cố định Khảo sát tỉ lệ giống Khảo sát thời điểm bổ sung giống Khảo sát thời gian lên men
Lên men với điều kiện tối ưu
Khả năng tái sử dụng của chế phẩm
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.2.2.1 Khảo sát các đặc điểm về giống vi sinh vật sử dụng trong đề tài
Các chủng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni, Acetobacter xylinum lần lượt được kiểm tra:
- Đặc điểm hình thái: quan sát đại thể thông qua quan sát khuẩn lạc sau 4 ngày nuôi cấy và quan sát vi thể các tế bào dưới kính hiển vi ởđộphóng đại 1000 lần.
- Khả năng sinh trưởng và phát triển: xây đựng đường cong sinh trưởng và lập
đường chuẩn của từng giống vi sinh vật.
3.2.2.2 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng
Oenococcus oeni tự do (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic
Để bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào thực hiện quá trình lên men malolactic ta cần xác định lượng giống vi khuẩn đưa vào sao cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Chúng tôi tiến hành bổ sung 3 tỉ lệ giống khác nhau là 5%, 7%, 10% vào dịch chanh dây đã lên men rượu 7 ngày và tiến hành lên men malolactic trong 4 ngày.
Sau khi quá trình lên men kết thúc chúng tôi thu mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, hàm lượng acid lactic, hàm
lượng acid malic, độrượu.
b. Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus
oeni trong lên men malolactic.
Khi bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào để lên men malolactic sẽ xảy ra sựtương tác giữa nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Oenococcus oeni.
Tương tác này có thể là kích thích, kìm hãm hoặc trung lập. Xác định các tương tác
này giúp cho việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên menmalolactic tốt cũng như tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường là một điều cần thiết. Do đó chúng tôi khảo sát các thời điểm khác nhau để bổ sung vi khuẩn
Sau khi đã có tỉ lệ giống Oenococcus oeni tối ưu, chúng tôi tiến hành bố trí các mẫu thí nghiệm như sau:
- Mẫu ĐC(MĐC): Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni.
- Mẫu 0 (M0): Bổsung đồng thời nấm men và vi khuẩn Oenococcus oeni.
- Mẫu 3 (M3): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 3 của quá trình
lên men rượu (thời điểm nấm men đang phát triển ở pha log).
- Mẫu 5 (M5): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 5 của quá trình
lên men rượu.
- Mẫu 6 (M6): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 6 của quá trình lên men rượu.
- Mẫu 7 (M7): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 7, sau khi kết thúc quá trình lên men rượu.
Tất cả các nghiệm thức được thu mẫu sau 11 ngày lên men (bao gồm 7 ngày
lên men rượu và 4 ngày lên men malolactic) và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, hàm lượng acid lactic, hàm lượng acid malic, độ rượu.
c. Khảo sát thời gian lên men malolactic
Sau khi xác định được tỉ lệ giống và thời điểm bổ sung giống vi khuẩn
Oenococcus oeni thích hợp, chúng tôi tiến hành lên men malolatic, khảo sát sự biến thiên của hàm lượng acid lactic, acid malic để chọn ra thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm có mùi vị tốt nhất.
Bảng 3. 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic
Thời gian Acid malic Acid lactic
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
3.2.2.3 Lên men tạo BC
a. Thu nhận BC
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơ đồ 3. 1 Sơ đồ thu nhận BC
b. Xử lý BC thô
BC tươi thu được sau lên men chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Xử lý BC tươi nhằm loại bỏ tạp chất và các tế
bào vi sinh vật để BC trở thành giá thể sạch và trơ.
Sơ đồ 3. 2 Xử lí BC thô
BC thô
Rửa và ngâm nước 1 ngày
Rửa và ngâm nước 1 ngày
Bảo quản lạnh
Nguyên liệu nước dừa già Giống Acetobacter xylinum
Lọc cặn Nhân giống cấp 1
Bổsung dinh dưỡng Nhân giống cấp 2
Thanh trùng (sau đó để nguội)
Cấy giống : 15% giống và 85% môi trường
Lên men tĩnh ( 7- 8 ngày)
c. Phương pháp xác định mật độ tế bào cố định được trên BC
Để xác định được mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên chất mang BC chúng tôi sử dụng đệm phosphate để phá mẫu. Cách tiến hành như sau: cho miếng BC cố định vào trong ống nghiệm chứa sẵn V (ml) dung dịch đệm phosphate 7.1, voltex
đều trong 1 phút rồi để yên trong 5 phút. Sau đó tiến hành đo OD dung dịch phá mẫu.
3.2.2.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC
a. Phương pháp hấp phụ
Nguyên tắc: Phương pháp hấp phụđể bẫy giống vi khuẩn cần cốđịnh hấp thụ lên chất mang BC. Sử dụng BC như một giá thể nuôi cấy vi khuẩn với hai giai đoạn:
- Áp dụng phương pháp hấp phụ để bẫy giống vi khuẩn hấp phụ lên chất mang BC.
- Sau quá trình hấp phụ, chất mang BC được trương nở bởi dịch môi trường và tế
bào giống vi khuẩn. Chất mang BC lúc này như một giá thể nuôi cấy vi khuẩn và được tạo điều kiện thích hợp để vi khuẩn phát triển.
Phương pháp cố định tế bào trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy - hấp phụ gồm hai giai đoạn: hấp phụ vi khuẩn trên bề mặt BC và bẫy tăng sinh trong chất mang BC.
- Giai đoạn hấp phụ: Ngâm BC trong dịch tế bào trong thời gian 30 phút, BC sẽ trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong cũng như trên bề mặt bên ngoài.
- Giai đoạn bẫy tăng sinh: Kế tiếp giai đoạn hấp phụ. Các tế bào đã được hấp phụ ở giai đoạn trên tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC.
Tiến hành phương pháp bẫy – hấp phụ
+ Bước 1: Ly tâm thu sinh khối giống
+ Bước 2: Phương pháp bẫy – hấp phụ vi khuẩn trên chất mang BC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuyển BC đã xử lý (được cắt nhỏ với kích thước 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm) và vô trùng, sinh khối vi khuẩn sau ly tâm thu được vào trong bình erlen 250 ml trong đó chứa 100 ml dịch môi trường Hansen. Với tỷ lệ BC phối trộn tương ứng với
kích thước 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm là 3: 2: 1 (45, 30, 15 miếng BC).
- Phương pháp A: ngâm trong thời gian 30 phút đến khi miếng BC trương nở hoàn