2.3.5.1 Biến đổi sinh học
a. Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong
lên men malolactic
Vi khuẩn malolactic có mặt trong tất cả các loại nho và rượu vang. Tùy thuộc
vào giai đoạn của quá trình làm rượu vang, điều kiện môi trường mà chúng sẽxác định khảnăng sinh sản của chính mình. Khi phát triển, chúng chuyển hóa một sốlượng lớn các chất.Vì thế mà vi khuẩn malolactic đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất rượu. Ảnh hưởng của chúng tới chất lượng rượu vang không chỉ phụ thuộc vào các yếu tố tác động vào môi trường ở cấp độ tế bào mà còn phụ thuộc vào việc lựa
chọn chủng vi khuẩn thích nghi nhất (Alexandre et al.,2004; Ribéreau-Gayon et al.,
2000; Steinkraus, 1992).
Trong giai đoạn lên men chính, vi khuẩn acid lactic chiếm số lượng nhỏ
(khoảng hơn 100 tế bào/g), vi khuẩn acetic và nấm men tìm thấy sốlượng nhiều hơn.
Oenococcus oeni chiếm số lượng nhiều hơn có trong lên men malolactic, xuất hiện ngay từ đầu trong quá trình lên men rượu vang. Pediococcus có thể tìm thấy hầu hết sau khi quá trình lên men malolactic bắt đầu xảy ra và nhiều nhất khi rượu có pH cao
hơn. Rượu vang có pH dưới 3.5 thông thường chỉ có Oenococcus oeni xuất hiện, trong
khi rượu có pH trên 3.5 thì thường có các vi khuẩn khác đặc biệt là các vi khuẩn lactic dị hình.
Quá trình tăng trưởng của vi khuẩn malolactic trong môi trường rượu vang gồm 4 pha:
- Pha thích nghi (pha lag): đây là giai đoạn vi khuẩn malolactic thích nghi với môi trường, một vài loại LAB có thể xuất hiện và lớn lên, đạt sốlượng 103 đến 104
CFU/ml, thường gặp là Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei, và một số lượng ít hơn là Leuconostoc oenos [Oenococus oeni] và Pediococcus cerevisiae. Số lượng tế bào vi khuẩn không tăng nhưng việc trao đổi chất vẫn diễn ra mạnh mẽ. Tuy nhiên ởgiai đoạn này chất dinh dưỡng đã bị nấm men sử dụng gần như cạn kiệt để tạo ra ethanol, vì thếmà lượng ethanol này có thể gây ức chế và kìm hãm sựtrao đổi chất của vi khuẩn malolactic. Sự thích nghi của vi khuẩn malolactic phụ thuộc vào quá trình xử lí nguyên liệu.
- Pha tăng trưởng (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn malolactic
đã thích nghi và sẽtăng trưởng với tốc độ sinh trưởng cực đại. Các tế bào còn sống sẽ
bắt đầu nhân lên đến khi sinh khối đạt ổn định và acid malic bắt đầu suy giảm trong pha này, chất dinh dưỡng chủ yếu được sử dụng để xây dựng vật chất tế bào và sinh sản.
- Pha cân bằng: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định, acid malic hầu như được phân giải hoàn toàn.
- Pha suy vong: các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết tăng
Đồ thị 2. 1: Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính trong lên men rượu [21]. Trong những ngày đầu của quá trình lên men rượu, vi khuẩn và nấm men đều sinh sản. Sau đó, chúng bắt đầu thích nghi hơn với môi trường và nhanh chóng tăng số lượng. Trong suốt thời gian này, vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh sản đểtăng sốlượng nhưng
bị giới hạn khi mật độ tế bào đạt 104 đến 105 CFU/ml. Việc tăng mật độ tế bào phụ
thuộc vào pH môi trường. Vi khuẩn malolactic đóng vai trò quan trọng trong lên men
malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quá trình lên men rượu,
khi đó mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml (Lonvaud-Funel, 1999; Osborn et al., 2000; Versari et al., 1999) [37].
Hơn nữa, vi khuẩn malolactic có thể được bổ sung vào các giai đoạn sau của quá trình lên men rượu: đồng thời với việc bổ sung nấm men, trong suốt quá trình lên
men rượu, vào khoảng kết thúc quá trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn tất quá trình
Đồ thị 2. 2: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic [37].
Đồ thị 2. 3: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men ethanol [37].
Lên men rượu
Tàng trữ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bắt đầu lên men malolactic Kết thúc malolactic
Đồ thị 2. 4: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men ethanol [21].
Quá trình lên men malolactic bắt đầu khi tế bào đạt đến pha tăng trưởng, tức ngay sau khi mật độ tế bào đạt 107 CFU/ml. Quá trình này được tiếp tục và kết thúc trong pha cân bằng hoặc ở giai đoạn đầu của pha suy vong. Trong điều kiện thuận lợi với nồng độ giới hạn của acid malic, quá trình lên men malolactic có thể hoàn thành
ngay trước khi kết thúc pha tăng trưởng. Lúc này mật độ tế bào tối ưu đạt 108 CFU/ml. Ngay sau khi sinh khối đã tăng đủ số lượng và đạt đến sự ổn định thì acid malic bắt
đầu bị suy giảm. Các vi khuẩn malolactic vẫn luôn luôn có mặt nhưng hoạt động của chúng còn tùy thuộc vào các điều kiện khác nhau, đặc biệt là nhiệt độ. Việc chuyển hóa 2g acid malic/ml có thể mất thời gian hơn việc chuyển hóa 4g acid malic/ml nếu mật độ tế bào thấp (Ribéreau-Gayon et al., 2000).
b. Sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men
Trong giai đoạn lên men malolactic, tác nhân vi sinh vật chính là vi khuẩn malolactic. Sự hiện diện của nấm men không đóng vai trò rõ rệt vì trong giai đoạn này hầu như nấm men không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất yếu và bước vào pha suy
vong, nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển. Một phần nấm men chết đi có
thể bị tự phân. Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phần của xác tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase) của chính bản thân tế bào. Trong quá trình này, hầu hết các protein, acid nucleic, lipid và
các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất có phân tử lượng thấp hơn
và hòa tan vào môi trường. Điều kiện để hiện tượng tự phân của tế bào xảy ra là tế bào
đã chết nhưng vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzyme hydrolase. Trong sản xuất
rượu vang truyền thống, người ta có thể tận dụng xác nấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cấn thiết cho vi khuẩn lên men malolactic phát triển.
c. Tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic
Sựtương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang. Bên cạnh việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, ta còn phải nghiên cứu những tương tác có lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường. Đã có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988).
Những nghiên cứu trên đều chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kích thích, kìm hãm, trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men.
Mức độ của những tương tác này còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sự tương tác của từng tổ hợp chủng nấm men/vi khuẩn malolactic cụ thể, sự hấp thu và giải phóng các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có khả năng kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic (Beelman và cộng sự, 1982; Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988; Henschke và Jiranek, 1993).
Đồ thị 2. 5: Giản đồ biểu diễn các kiểu tương tác khác nhau (kích thích , kìm hãm , không tương tác ) giữa 77 chủng nấm men và 3 chủng vi khuẩn thuộc
Khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường đề
cập đến 2 khía cạnh chính:
Nhiều chủng nấm men có khảnăng gây nên những tác động kích thích hoặc kìm hãm
đến sựsinh trưởng và khảnăng lên men vi khuẩn malolactic.
Ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men:
Một vài loài nấm men có khả năng góp phần vào quá trình lên men malolactic,
nhưng vai trò này đã bị phủ định bởi chức năng chính của nấm men là chuyển hóa chất dinh dưỡng thành cồn. Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế của nấm men đến vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Tuy nhiên đã có nghiên cứu cho thấy rằng những ảnh hưởng của nấm men lên vi khuẩn là hạn chế sự phát triển và tồn tại do sản phẩm tạo ra hay sự cạnh tranh chất dinh dưỡng của nấm men. Những
nghiên cứu của Lallemand ở phòng thí nghiệm cho biết nấm men tạo chất kháng
khuẩn làm hạn chế sự phát triển của Oenococcus oeni. Chất kháng khuẩn này là các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men như ethanol, SO2, các acid béo mạch trung bình và protein. Đó là các chất kháng khuẩn tự nhiên.
- Ethanol có khả năng ức chế các vi khuẩn nói chung kể cả vi khuẩn
malolactic. Người ta thấy rằng đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh mẽ
lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khảnăng lên men malolactic của vi khuẩn này. Theo Capucho và San Romao (1994): ở nồng độ 4% (v/v), ethanol đã có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acid malic của vi khuẩn vày vẫn đạt được 95%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- SO2 sinh ra từ nấm men cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulfhite hóa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vi khuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men. Người ta thấy rằng, hầu hết các chủng nấm men có khảnăng tổng hợp được SO2 với hàm lượng lên đến 30mg/l, một số ít có thể sinh ra SO2 nhiều hơn, thậm chí hơn 100mg/l (Rankine và Pocock, 1969; Eschenbruch, 1974; Dott và cộng sự, 1976; Suzzi và cộng sự, 1985).
- Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic,
octanoic… cũng có khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vi
khuẩn lactic, cụ thể: acid decanoic có khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩn malolactic (Edwards và Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel và
cộng sự, 1988). Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và San
Ronao(1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12.5mg/l decanoic và 2.5 mg/l dodecanoic) kích thích khảnăng lên men malolactic của vi khuẩn
nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại. Sự có mặt đồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic có thểgây tác động ức chế đến sinh
trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từng loại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988).
- Sự tạo thành các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Theo nghiên cứu của Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này có bản chất là
protein tích điện âm. Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và có ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhau trong sản xuất rượu vang (H.Alexandre và cộng sự, 2004).
- Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do sự cạn kiệt về nguồn chất dinh dưỡng. Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn sinh
trưởng và lên men ethanol. Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt
đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitamin hầu như không
còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển.
Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men
Tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men ít được nghiên cứu
hơn. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Fornachon (1968), sự kích thích khả năng lên
men malolactic của vi khuẩn có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men. Khi nấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ gồm các acid amin, peptid, protein và vitamin. Ngoài ra những phân tử lớn khác như glucan,
mannoprotein cũng được giải phóng trong quá trình tự phân nấm men và kích thích sự
phát triển của vi khuẩn. Các hợp chất này rất cần thiết cho sựsinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:
- Các phân đoạn nitơ khác nhau đối với sinh trưởng vi khuẩn malolactic. Hiện nay vẫn chưa có một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hóa các loại peptide ở các vi khuẩn malolactic. Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sựảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong
môi trường vang đến sựsinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic. Các nghiên cứu trên đều cho thấy, khi sử dụng các phân đoạn nitơ khác nhau gồm các phân đoạn có phân tửlượng lần lượt là <0.5; 0.5 –1.0; 1 – 10; >10 kDa thì các acid amin tự do và
đoạn peptide có phân tử lượng <1 kDa có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn rất tốt so với các phân đoạn có phân tử lượng lớn hơn gồm các đại phân tử >10kDa và các đoạn peptide 1 – 10 kDa (Feuillat và cộng sự, 1977; Guilloux-Benetier và Chassagne, 2003).
- Vai trò của hợp chất nitơ cao phân tử đối với hoạt tính enzyme thủy phân protein của vi khuẩn malolactic.
Nghiên cứu của Lonvaud-Funel và cộng sự (1988) lại cho thấy rằng các phân
đoạn protein có phân tử lượng > 12kDa cũng đóng vai trò như một chất cảm ứng và góp phần quan trọng trong việc làm tăng hoạt tính của các enzyme exoprotease của vi khuẩn malolactic. Trên cơ sở đó, nghiên cứu của Guilloux-Benetier (1993, 1995) đã cho thấy ảnh hưởng của các hợp chất cao phân tử sinh ra từ quá trình tự phân của nấm
men đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic. Những chất này bao gồm các polysaccharide thành tế bào và các phân tử protein. Việc bổ sung các hợp chất cao phân tử từ dịch chiết nấm men vào canh trường lên men malolactic có khảnăng kích
thích hoạt tính các enzyme aminopeptidase ở O.oeni. Do vậy, vi khuẩn này có thể
thủy phân được các phân đoạn nitơ cao phân tử có trong vang ở cuối giai đoạn lên men chính. Nhờ đó, nó góp phần giúp rút ngắn pha thích nghi và làm tăng tốc độ tổng hợp sinh khối của vi khuẩn malolactic. Nghiên cứu của Farias và Manca de Nadra (2000) cũng đã làm sáng tỏ khả năng phân giải các phân đoạn protein ở vi khuẩn
O.oeni có khảnăng làm tăng hàm lượng các amino acid và peptide trong dịch lên men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
rượu vang.
Sựức chế nấm men bởi vi khuẩn malolactic
Sự có mặt của các chủng vi khuẩn malolactic hoạt động mạnh có thể không ảnh
hưởng đến nấm men ở pha sinh trưởng. Nhưng đến giai đoạn suy vong, nó làm tăng
tốc độ chết của nấm men do hình thành nên các chất ức chế hoặc làm cạn kiệt các chất
dinh dưỡng và các yếu tốsinh trưởng cần thiết của nấm men. Do vậy, sựức chế nấm men bởi vi khuẩn malolactic chỉ có thể xảy ra ở giai đoạn cuối trước khi kết thúc quá
trình lên men chính. Các nguyên nhân dẫn đến sựức chế này có thể giải thích theo các
cơ chế sau:
- Cơ chế thứ nhất liên quan đến khả năng ức chế nấm men bởi các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn malolactic như propionate và acetate. Ngoài ra sự sinh
trưởng của vi khuẩn còn làm tổn thất một lượng đáng kể carbohydrate cần thiết cho nấm men. Từđó làm giảm tốc độ sinh tổng hợp ethanol và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
- Cơ chế thứ hai để giải thích cho khả năng ức chế nấm men của vi khuẩn malolactic là chúng có khả năng phân giải thành tế bào nấm men nhờ enzyme β-1.3-