1 3.2 Chẩn ủ oỏn mụ bệnh học
2.4.2. Nghiờn cứu mụ bệnh học:
Chỉ ủịnh: Trong nghiờn cứu này, với những bệnh nhõn ở bệnh viện K, bệnh phẩm ủược lấy ở những bệnh nhõn cú tổn thương nghi ngờ, hoặc viờm nặng cú chỉ ủịnh làm LEEP nờn tất cả số bệnh nhõn ủều ủược làm xột nghiệm MBH.
2.4.2.1.Dụng cụ - hoỏ chất ủể làm xột nghiệm mụ bệnh học:
- Mỏ vịt.
- Kỡm sinh thiết cổ tử cung .
- Gạc dài ủặt õm ủạo sau sinh thiết.
- Dung dịch formol 10% : Cốủịnh bệnh phẩm sinh thiết.
2.4.2.2 Kỹ thuật lấy mẫu và ủọc kết quả.
Mỗi bệnh nhõn ủược lấy sinh thiết 1-3 mảnh ở vựng chuyển tiếp của cổ tử cung. Trước khi cốủịnh, mỗi mảnh sinh thiết ủược dàn làm một phiến ủồ, sau ủú, ủược cố ủịnh ngay trong dung dịch formol 10%. Tiến hành chuyển, ủỳc và cắt nhuộm theo phương phỏp thụng lệ (cỏc tiờu bản ủược nhuộm Hematoxylin và Eosin ).
Cỏc tiờu bản ủó hoàn thành ủược ủọc dưới kớnh hiển vi quang học thụng thường và phõn loại theo phõn loại của Tổ chức Y tế thế giới ( WHO ) năm 1992.
* Cỏc kết quả xột nghiệm tế bào và mụ bệnh học ủều ủược GS.TS Nguyễn Vượng kiểm ủịnh lạị
2.4.3.Nghiờn cứu bằng kỹ thuật PCR:
Kỹ thuật PCR ủược thực hiện tại labụ khoa sinh học phõn tử - miễn dịch, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và do tiến sĩ Nguyễn Thị Lan Anh trực tiếp thực hiện.
2.4.3.1.Dụng cụ, trang thiết bị, hoỏ chất nghiờn cứu:
+ Dụng cụ:
- Mỏy PCR: mỏy xỏc ủịnh trỡnh tự DNA tựủộng. - Tủ lạnh sõu -200 và -700. - Lũ vi súng. - Mỏy lắc ổn nhiệt 370C. - Mỏy khuấy từ. - Mỏy làm khụ và hỳt chõn khụng. - Mỏy ly tõm lạnh và ly tõm ủể bàn. - Mỏy khuấy trộn Vortex.
- Bộủiện di DNA và bộ nguồn ủiện dị - Mỏy soi thạch và chụp ảnh tựủộng. - Tủ cấy vụ trựng.
- Pipet cỏc loại và cỏc dụng cụ thuỷ tinh khỏc.
Dụng cụ phải ủược vụ trựng tuyệt ủối (hấp ướt 1200C trong 20 phỳt). + Vật liệu: Hoỏ chất và sinh phẩm:
- Tỏch chiết DNA: - Kid QIA amp viral DNA minikit - Chloroform và phenol, EM Scientific - Ethanol 100%, AA PEA Alcohol
- Ultrapure distilled water, Nuclease Free, Gibco - Invitro - Temperature – regulated centrifuge, eppendorf 5415R
- Chạy PCR: chỳng tụi sử dụng bộ PCR Kit do hóng Qiagen cung cấp. Bộ Kit bao gồm: - Taq polymerase 5 units / 1Ml
- d NTP 2,5 mM - 10 ì PCR Buffer - MgCL2 25 mM - Distilled water + Cỏch lấy mẫu:
Sinh thiết lấy một mẩu nhỏ bệnh phẩm ở cổ tử cung, ủể khụ tự nhiờn. Ngay sau ủú, cho mẫu vào tỳi nilon sạch, bảo quản ở nhiệt ủộ -200C cho ủến khi tiến hành tỏch DNA tổng số.
+ Quy trỡnh kỹ thuật:
- Bước 1 : Thu nhận mẫu bệnh phẩm.
- Bước 2 : Tỏch chiết DNA tổng số bằng DNA Minikit. - Bước 3 : Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi :
* Cặp mồi ủỏnh giỏ quỏ trỡnh tỏch chiết DNA : Sử dụng cặp mồi PC 03/05 cho bước kiểm tra chất lượng DNẠ
* Cặp mồi phỏt hiện DNA của HPV: Hai cặp mồi MY 09 /11 và GP 5+/ 6+ cho phản ứng Neted – PCR phỏt hiện sự cú mặt của HPV.
- Bước 4 : Phản ứng PCR: Sử dụng phản ứng Multiplex – PCR: là kỹ thuật sử dụng hai hay nhiều cặp mồi riờng biệt vào trong cựng một hỗn hợp phản ứng. Chu kỳ gia nhiệt cho multiplex – PCR tuỳ thuộc vào nhiệt ủộ tối ưu của từng cặp mồị í nghĩa của multiplex – PCR là trong cựng một phản ứng, cú thể vừa kiểm tra hiệu quả tỏch DNA vừa cú thể kiểm tra sự hiện hữu của HPV.
Hỡnh 2: Mụ hỡnh phản ứng chuỗi trựng hợp PCR.
- Bước 5 : ðiện di sản phẩm PCR trờn gel agarose sau ủú ủọc kết quả phản ứng dưới ỏnh sỏng tia UV của mỏy chụp gel.