D u soi kính hi n vi Gi y lau v t kính hi n vi
Khuyên c y/ pipet Pasteur Giá ng nghi m
Lam kính, lamen Ng n l a đèn Gas
B.PH NGăPHÁP NGHIÊN C U
H i c u, mô t c t ngang.
Phân l p, đnh danh các vi khu n Escherichia coli trên môi tr ng chuyên bi t. D a vào khu n l c đ c tr ng t đó đnh danh vi khu n b ng các ph n ng sinh hóa chuyên bi t. Xác đnh m c đ kháng kháng sinh c a các vi khu n phân l p đ c b ng ph ng pháp Kirby-Bauer theo h ng d n c a NCCLS – 2006 (Hoa k ).
Môi tr ng, sinh ph m và đ a kháng sinh c a hãng Bio-Rad. Thu th p và nh p d li u vào s và Excel.
C.K THU T NGHIÊN C U[16,17,18, 24, 25]
L y chai c y máu d ng tính
K t qu nhu m gram, c y. c và nh n d ng khóm trùng
nh danh b ng test sinh hóa, làm kháng sinh đ
mơi tr ng đư c y CA,BA 35- 370C,5% CO2/18- 24h BCP 35- 370C/18-24h. SAD: 1 ng t0phòng,1 ng t m
c phân tích k t qu . Hồn t t báo cáo. Tr k t qu cho lâm sàng Báo k t qu s kh i cho lâm sàng hình d ng, màu gram, cách s p x p.
L u Ủ:
C u khu n đôi chu i đ t Optochin, Bactritracin trên BA. Tr c khu n nh Gram âm vach 1 đ ng S.aureus trên BA Nhu m gram th y n m thì c y trên SAD.
Soi t i Nhu m gram C y trên môi tr ng CA, BA, BCP
M u n c ti u
Soi nhuôm gram
C y phân l p đ nh l ng trên BA và URI BA 35- 370C,5% CO2/18-24h
URI 35- 370C/18-24h.
nh danh b ng test sinh hóa, làm kháng sinh
đ
c phân tích k t qu . Hoàn thành báo cáo Tr k t qu cho lâm sàng Không B ch c u Khơng Vi khu n Có Vi khu n nhi u h n 2 lo i hình th vi khu n rõ ràng Không Vi khu n ≥ 1 B ch c u/ vi tr ng <1B ch c u/vi tr ng Có Vi khu n 1 hay 2 lo i hình th K t q a nhu m Gram, c y. c và nh n d ng khóm trùng
Âm tính Ngo i nhi m
I. K THU T L Y M U[24,25]
I.1. Th iăđi m l y m u
- Càng giai đo n s m c a b nh càng t t. Ngh a là ti n hành l y m u ngay sau khi có chu n đốn lâm sàng.
- Nên l y m u tr c khi b nh nhân dùng kháng sinh h th ng.
- i v i m u máu t t nh t là khi b nh nhân đang n l nh ho c l nh run tr c khi s t ho c đang c n s t.
I.2. Ph ngăphápăl y m u
I.2.1. M u máu
- Chai c y máu đ nhi t đ phòng 15’ tr c khi b m máu vào. Sát trùng chai b ng c n 70%. Ch n gòn t m c n 70% lên trên
- Ch n t nh m ch rõ nh t ch n dây garo phía trên cách ch đ nh l y máu 5cm.
- Sát khu n vùng da đã ch n t nh m ch: dùng k p gòn nhúng vào d ch sát khu n( ddpovidine 3.5% t t nh t là dd Chlohexine), lau theo vòng đ ng tâm t trong ra ngoài, đ i cho dd providine khơ. Sau đó lau s ch povidine b ng bong gòn th m c n 70%.
- Làm l i l n sát khu n nh trên, đ i cho dd sát khu n khô (n u đ t b m t da s là nguyên nhân gây ngo i nhi m).
- L u Ủ: sau khi sát khu n n i l y máu, khơng l y ngón tay s n n tìm m ch,vì nh v y s làm vùng da l y máu s b nhi m khu n tr l i.
- Tiêm kim tiêm vào t nh m ch, kéo lui nòng nh nhàng và l y đ l ng máu c n thi t , tránh t o b t khí.
- Tháo dây garo, rút kim tiêm ra, ép nh bong thâm c n 70% vào ch tiêm. B gòn trên chai c y máu ch khô.
- B m ngay m u máu vào chai c y máu, thao tác b m nh nhàng tránh tán huy t . Kh trùng l i nút đ y chai c y máu sau khi l y tiêm ra.
I.2.2. M uăn c ti u
i v i bé trai:
- Cho b nh nhân v sinh tay, quy đ u và vùng sinh d c.
Hình 2.3: L vơ trùng.
- Cho b nh nhân đi ti u, b đi m t ít n c ti u đ u dịng, sau đó nh n l i. Dùng l vơ khu n h ng n c ti u vào l kho ng 3 –5ml, sau đó cho b nh nhân ti u b hoàn toàn.
i v i bé gái:
- Ng i l y m u nên r a tay b ng xà phịng, lau khơ b ng kh n s ch.
- R a b ph n sinh d c ngồi b ng xà phịng th t s ch, th m khô b ng g c vô khu n, gi cho các môi c a âm đ o tách bi t. Dùng l vô khu n l y n c ti u gi ng cách c a bé trai.
I.3.ăL ng b nh ph m
- M u máu: yêu c u 2_5ml đ i v i tr em, 1_2 ml đ i v i tr s sinh.Cho vào trong chai c y máu Bactec
- M u n c ti u: kho ng 3_ 5ml
I.4. V t li u l y m u và chuyên ch
I.4.1. V t li u l y m u
- i v i m u máu: máu s đ c l y vào chai c y máu Bactec
- i v i n c ti u: n c ti u s đ c l y vào l vô trùng
I.4.2. V t li u chuyên ch
L y càng s m càng t t ngay sau khi có chu n đốn lâm sàng và tr c khi dùng kháng sinh, chuy n đ n khoa Vi sinh và kh o sát ngay. N u vì lỦ do nào đó khơng th kh o sát ngay thì có th gi m u b nh ph m trong t l nh nhi t đ 2-30C nh ng không quá 2 gi t khi l y m u
II. K THU T NH NăVẨă NGăKệăM U[9,24,25]
II.1. M u máu
- B nh ph m là m u máu đ c ch a trong chai c y máu Bactec đ c g i t các khoa lâm sàng t i b nh vi n nhi ng II t tháng 11/2013 đ n tháng 4/2014..
- Thông tin v đ tu i, gi i tính đ c ghi vào phi u xét nghi m. Có s liên h ch t ch gi a khoa đi u tr và phịng vi sinh đ ghi nh n thơng tin đ y đ và chính xác.
- t các chai BACTEC đư có m u b nh ph m vào trong máy c y máu BACTEC các chai này s đ c máy t đ ng ki m tra. Thi t b s d ng ph ng pháp theo dõi hu nh quang. Môi tr ng đ c thi t k đ cho vào đ n 5 ml máu. Th tích m u càng nhi u thì kho ng phát hi n cao h n và th i gian phát hi n càng nhanh.M i chai.
- Máy có g n c m bi n nh y c m v i n ng đ CO2 do vi sinh v t sinh ra trong qúa trình trao đ i ch t ho c l ng O2 tiêu th do s sinh tr ng c a vi sinh v t. S t ng tín hi u hu nh quang do b ph n c m bi n phát ra đ c máy ghi nh n m i 10’, c ng đ t ng hàm l ng CO2 ho c gi m hàm l ng O2 trong chai máu. K t qu d ng tính đo đ c cho th y s hi n di n c a vi khu n trong chai máu.
II.2 M uăn c ti u
- B nh ph m là: n c ti u đ c g i t các khoa lâm sàng t i b nh vi n nhi ng II t tháng 11/2013 đ n tháng 4/2014.
- Thông tin v đ tu i, gi i tính đ c ghi vào phi u xét nghi m. Có s liên h ch t ch gi a khoa đi u tr và phịng vi sinh đ ghi nh n thơng tin đ y đ và chính xác.
III.1. M u máu
III.1.1. Soi tr c ti p
- Khi máy c y máu báo có m u ch ng d ng l y các chai d ng ra kh i máy
c y.(ki m tra mã code trên chai máu và phi u xét nghi m)
- Sát khu n đ u chai máu BACTEC b ng c n, đ khô. L c đ u h đ u chai trên ng n l a đèn gas
- Dùng ng chích vơ trùng l y 1 l ng máu nh : 1 gi t lên lam s ch.
- Ti n hành soi tr c ti p v t kính 10x và 40x đ xem hình d ng vi khu n, tính di đ ng c a vi khu n và xem có n m hay khơng.
III.1.2. Kh o sát vi th
- Khi máy c y máu báo có m u ch ng d ng l y các chai d ng ra kh i máy
c y.(ki m tra mã code trên chai máu và phi u xét nghi m)
- Sát khu n đ u chai máu BACTEC b ng c n, đ khô. L c đ u h đ u chai trên ng n l a đèn gas
- Dùng ng chích vơ trùng l y 1 l ng máu nh : 1 gi t lên lam s ch, tr i thành m t ph t kho ng 2_3 cm, đ khô t nhiê,c đ nh b ng nhi t.
- Ti n hành nhu m gram đ xác đnh l i hình d ng vi khu n cách b t màu gram âm hay gram d ng.
III.2. M uăn c ti u
Kh o sát vi th
- L c đ u n c ti u dùng Pipette paster l y l ng ít n c ti u nh 1 gi t 0,05ml, không dàn đ u, đ khô t nhiên, c đnh b ng nhi t
- Ti n hành nhu m gram đ xem s hi n di n c a vi khu n, n m và b ch c u đa nhân
- c k t qu nhu m soi ghi nh n s l ng b ch c u và vi khu n đư soi:
- B ch c u ni u
- N u có < 1 b ch c u/ vi tr ng: k t lu n không nhi m khu n ni u
- N u có 1_3 b ch c u/ vi tr ng: k t lu n nghi ng nhi m khu n ni u
- N u > ho c = 3 b ch c u/vi tr ng : k t lu n nhi m khu n ni u
- Vi khu n ni u
- N u > ho c = 1 vi khu n/ vi tr ng: k t lu n nhi m vi khu n ni u( >ho c =105 vi khu n/ ml
- N u<1 vi khu n/ vi tr ng thì xem bach c u có l n h n 3 b ch c u/ vi tr ng khơng n u có k t lu n nhi m vi khu n ni u còn tr ng h p cịn l i thì khơng nhi m.
- Nhu m gram khơng có b ch c u hay vi khu n thì k t lu n âm tính cịn ng c l i thì ti n hành ni c y phân l p xác đnh vi khu n
IV. K THU T NHU M GRAM18,8]
IV.1. Nguyên t c
Do s khác bi t v c u trúc vách t bào vi khu n nên vi khu n Gram d ng gi đ c màu tím c a ph c h p Gentian-iod không b t y màu b i alcohol. Trong khi đó, vi khu n Gram âm không gi đ c màu c a ph c h p này sau khi t y b ng alcohol.
IV.2. Ti n hành
- Ghi tên m u ho c s nh n di n trên lam (lam ph i s ch và khô).
- Dùng vịng c y l y m t ít b nh ph m ( máu, n c ti u) tr i đ u trên mi ng lam.
- C đ nh b ng cách đ a nh nhàng lam kính c t ngang ng n l a đèn c n 2-3 giây tránh làm quá nóng, tránh ch m ngón tay vào m t lam kính
- t lam đư ph t m u lên giá đ ng.
- Nh vài gi t Crystal violet cho ph đ u lên b m t ph t nhu m và đ yên trong 1 phút.
- b dung d ch Crystal violet và r a s ch lam kính t t , nh nhàng b ng n c máy.
- Lugol cho ph trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1 phút.
- R a l i lam b ng n c máy t t và nh nhàng.
- T y màu b ng cách c m m t đ u lam và nh t t Alcohol 95% ho c Alcoholậ
Acetol lên ph t nhu m cho đ n khi vùng phi n kính b c màu đi (thong th ng là t 10 đ n 15 giây).
- R a nhanh b ng n c (m s n vòi n c tr c khi b t đ u kh màu).
- Nh vài gi t Safrafin cho ph đ u lên trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1phút.
- R a nhanh b ng n c nh nhàng và đ khô t nhiên và quan sát d i kính hi n vi v t kính d u ×100 (v t kính ×10), tìm các t bào b ch c u hay t bào m (là các t bào tròn nh h n, n đ m màu trên toàn t bào).Vi khu n Gram d ng b t màu tím, Gram âm b t màu h ng.
IV.3. K t qu
- Vi khu n Gram (+) b t màu tím và vi khu n Gram (-) b t màu h ng.
- K t qu nhu m Gram bao g m: tính ch t Gram (+/-), hình d ng vi khu n (c u khu n, tr c khu n), cách s p x p (chu i, chùm, r i r c...).
V. K THU T C Y PHÂN L P[18,24,25]
V.1. Nguyên t c
- i v i m u máu: c y phân l p tách riêng bi t t ng t bào vi sinh v t trên môi
tr ng nuôi c y. T m t t bào ban đ u sau m t th i gian nuôi c y s t o ra m t khóm hay khu n l c.
- i v i m u n c ti u: c y đ nh l ng đ tách riêng t ng t bào vi sinh v t tr i b nh ph m trên m t th ch và đ m đ c s l ng khu n l c m c trên môi tr ng
ni c y
V.2. Quy trình
V.2.1. M u máu
- Khi máy c y máu báo có m u ch ng d ng l y các chai d ng ra kh i máy c y.(ki m tra mã code trên chai máu và phi u xét nghi m)
- Sau khi ti n hành nhu m soi thì ti n hành c y máu theo ph ng pháp vô khu n.
- Sát khu n đ u chai máu BACTEC b ng c n, đ khô. Dùng ng chích vơ trùng l y 1 l ng máu nh : nh vào góc đ a CA, BA, BCP m i lo i 1-2 gi t m u.
- t đ khuyên c y đ ngu i sau đó c y ria theo đ ng zig zag 4 chi u m t th ch t đi m có m u.
- N u k t qu n soi t i th y có s xu t hi n c a n m thì ti n hành c y ria trên th ch SAD.
- N u k t qu soi nhu m gram th y có vi khu n hình d ng c u khu n gram d ng đ ng thành đơi chu i thì đ t thêm đ a optochin và bacitracin trên th ch BA.
- môi tr ng
BCP đư c y trong t m trong 18-24 gi .
SAD: 1 ng đư c y đ nhi t đ phòng, ng còn l i trong t m
- Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi , tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh lồi và làm kháng sinh đ .
V.2.2. M uăn c ti u
- Sau khi nhu m soi phát hi n vi khu n, b ch c u ti n hành c y n c ti u theo ph ng pháp vô khu n.
- Dùng que c y có dung l ng khơng đ i 0,01 ml và 0,001 ml đ c y.
- L c k n c ti u, kh trùng que c y trên ng n l a đèn gas.
Trên CA, t o khu n l c tròn, to, màu tr ngăđ c,
bóng, l i
Trên BA, vi khu n m c m nht o khu n l c trịn, to, màu tr ngăđ c, bóng,
l i
Trên BCP, t o khu n l c nh y, to, lên men môi
tr ng chuy n sang màu vàng
Hình 2.4: K t qu ni c y phân l p E.coli trên các
- L y 0,01 ml n c ti u c y m t đ ng th ng theo đ ng kính c a đ a th ch BA và Uri Select 4, sau đó dùng que c y ria đ u tồn b n c ti u ra hai bên theo đ ng zig zag.
- môi tr ng
em h p BA trong t m 370C có 5% CO2 trong vịng 18 _24 gi
Uri Select 4 trong t m 370C trong vòng 18 – 24 gi .
VI. K THU TăTESTăSINHăHịAă NH DANH[2,16,24,25]
Hút 10ml n c mu i sinh lý cho vào tube vô trùng.
Ch n khu n l c đ c tr ng c a t ng loài vi khu n, dùng pipet l y 3-4 khu n l c đ c tr ng