Hiện nay trong sinh sản nhân tạo các loài cá, chất kích thích sinh sản đƣợc sử dụng thông dụng gồm 3 nhóm chính [1]:
- Nhóm thứ nhất: gồm các loại chế phẩm kích dục (kích dục tố), là não thùy thể (tuyến yên) của cá và HCG.
Hoạt chất của não thùy lấy ở các loài thích hợp nhƣ cá thuộc nhóm cá chép (chép, mè, trắm...), cá da trơn (tra, trê...) có tác dụng kích thích tuyến sinh dục phát triển, thúc đẩy sự thành thục hoàn toàn, gây chín và rụng trứng ở cá cái hoặc tiết tinh dịch ở cá đực. Liều lƣợng sử dụng não thùy cho cá bố mẹ sinh sản tùy thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ chất lƣợng hoạt tính của não thùy, mức độ thành thục, hệ số thành thục, nhiệt độ nƣớc và các điều kiện khác của môi trƣờng chứa cá sau khi đƣợc tiêm thuốc kích thích giống nhƣ các yếu tố ở bãi đẻ tự nhiên của cá. Cá đƣợc tiêm một hay nhiều lần cũng tùy thuộc vào từng loài cá. Tuy nhiên hạn chế của việc sử dụng não thùy là sự không ổn định của hoạt tính trong não thùy và phải giết chết cá để lấy sản phẩm. Ngoài ra khi sử dụng não thùy rất dễ xảy ra các phản ứng phụ không có lợi cho cá sinh sản vì trong não thùy có chứa nhiều loại hormon khác nhau.
HCG (Human Chorionic Gonadotropin) là một Glycoprotein tan trong nƣớc. HCG đƣợc chiết xuất từ nƣớc tiểu phụ nữ có thai dựa vào nguyên lý tách protein tan trong nƣớc. Đây là hormon kích thích sinh sản, làm giải phóng tinh trùng và tế bào trứng trong tuyến sinh dục đã thành thục của cá. HCG gây đƣợc những phản ứng oxy hóa cho các enzym chuyển hóa protein và lipid nhƣ Dehydrogenaza và Estaraza của cá mè trắng tƣơng tự nhƣ não thùy của cá chép trên loài này. HCG đƣợc coi là loại kích dục tố dị chủng thông dụng gây rụng trứng hiệu quả cho nhiều loài cá. Liều lƣợng dùng từ 4.000 - 8.000 UI/kg cá cái cho nhiều loài cá.
- Nhóm thứ hai: là tổ hợp hoạt chất của GnRH-a (Gonadotropin Releasing Hormon analog), một chất tổng hợp tƣơng tự hormon phóng thích kích dục tố từ
18
tuyến yên và một chất kháng Dopamin (chống lại tác dụng ngăn cản sự tiết kích dục tố của dopamin nội sinh) để kích thích giải phóng các hormon sinh dục. Có nhiều loại GnRH-a là LH-RHa của Trung Quốc, Buserelin (Suprefact nasal) của Đức, Ovapim của Canada. Phƣơng pháp sử dụng chất tổng hợp có tên LH-RHa (Leutinising Hormon Releasinh Hormon analog) cùng với chất kháng dopamin trong việc kích thích sinh sản cá đƣợc gọi là phƣơng pháp Linpe.
- Nhóm thứ ba: các hormon steroid, là những chất hữu cơ phức tạp mà trong phân tử có các nguyên tử Carbon tạo thành 4 mạch vòng, ba mạch có 6 đỉnh và 1 mạch có 5 đỉnh. Các steroid đều không tan trong nƣớc nhƣng tan trong dung môi hữu cơ. Trong sinh sản cá, các steroid đƣợc cho hòa tan trong dung môi là cồn hay dầu thực vật. Các steroid sinh dục giữ vai trò quan trọng trong cơ chế hormon tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính, điều hòa sự phát triển tuyến sinh dục, nhất là sự tạo noãn hoàng, sự thành thục và rụng trứng. Hầu nhƣ các steroid gây rụng trứng trên cá đƣợc sử dụng chỉ trong liều tiêm quyết định.
19
CHƢƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nghiên cứu về cá Chạch lửa
- Tập hợp và thuần dƣỡng đàn cá bố mẹ - Nuôi vỗ cá bố mẹ
- Kích thích sinh sản
- Ƣơng nuôi cá bột lên cá hƣơng và cá giống
- Khảo sát một số loại bệnh trong ƣơng cá giống và cá bố mẹ.
2.1.2.Nghiên cứu về cá Hổ
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học (phân loại, hình thái)
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản (Kích cỡ cá sinh sản, mùa vụ sinh sản, tỷ lệ đực cái, hệ số thành thục và sức sinh sản)
-Bƣớc đầu nghiên cứu thăm dò sinh sản nhân tạo: Nuôi vỗ cá bố mẹ, kiểm tra mức độ thành thục và kích thích sinh sản
2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Trung Tâm quốc gia giống thủy sản nƣớc ngọt Nam Bộ, xã An Thái trung, huyện Cái bè, tỉnh Tiền giang.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu: từ 6/2010 - 12/2012 (sau khi đã đƣợc điều chỉnh)
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Cá Chạch lửa (Mastacembelus erythrotaenia Bleeker, 1870) - Cá Hổ (Datnioides undecimradiatus Roberts & Kottelat, 1994)
Trong nghiên cứu này, lúc đầu do có sự nhầm lẫn giữa cá hổ Thái Lan (có sọc to) và cá hổ Việt Nam (có sọc nhỏ) còn xếp chung một loài. Tuy nhiên sau khi tập hợp cá để thuần dƣỡng và đối chiếu với hệ thống phân loại của M. Kottelat [33] thì loài cá hổ đang nghiên cứu là loài cá hổ sọc nhỏ, tên khoa học là Datnioides undecimradiatus
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của cá Thái hổ
20
- Nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng: xác định mối tƣơng quan giữa chiều dài và khối lƣợng cá.
- Nghiên cứu xác định tính ăn của loài: quan sát hình thái giải phẫu ống tiêu hóa của cá. Xác định phổ thức ăn và thành phần thức ăn tự nhiên trong ống tiêu hóa của cá.
2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản
- Tuổi và trọng lƣợng thành thục lần đầu của cá đƣợc tính bằng công thức tần xuất chiều dài I.F.Pravdin (1963) hoặc xác định trực tiếp cá nuôi từ nhỏ đến khi thành thục. Với cá nuôi trong bể thì tính từ khi cá có dấu hiệu thành thục, các đặc điểm sinh dục và sinh dục phụ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xác định giai đoạn phát triển tế bào trứng theo kết quả quan sát tiêu bản mô học trên cơ sở bắt màu thuốc nhuộm khác nhau của các thành phần trong trứng theo phƣơng pháp Mallory.
- Xác định độ béo của cá để đánh giá khả năng chuyển hóa thành thục: Nghiên cứu độ béo của cá (I.F. Pravdin,1963)
●
Trong đó:
W: khối lƣợng toàn thân (gam)
Lo: chiều dài cá tính từ đầu mõm đến hết cuống đuôi(cm)
●
Trong đó:
W0 :trọng lƣợng bỏ nội quan (gam)
Lo : chiều dài tính từ đầu mõm đến hết phần cuống đuôi (cm) Clark (%) = Wo x 100 Lo3 W x 100 (2) (1) Fulton (%) = W x 100 Lo3 W x 10 0
21
- Xác định hệ số thành thục (GSI) để đánh giá mùa vụ sinh sản và sức sinh sản của cá cao hay thấp. Theo công thức (3):
- Xác định sức sinh sản:
● Sức sinh sản tuyệt đối (F) của cá đƣợc xác định theo Banegal (1967)
Trong đó:
G: trọng lƣợng buồng trứng (gam).
g: trọng lƣợng một mẫu trứng đƣợc lấy ra để đếm (gam).
n: số lƣợng trứng có trong 1 mẫu trên (mẫu trứng đƣợc lấy để đếm ở 3 vị trí đầu, giữa và cuối buồng trứng)
● Sức sinh sản tƣơng đối
- Xác định sự biến đổi đƣờng kính trứng: đƣờng kính trứng đƣợc xác định bằng thƣớc đo trên kính hiển vi soi nổi. Trứng đƣợc lấy ở 3 vị trí đầu, giữa và cuối của buồng trứng với số lƣợng 30 tế bào trứng trên 1 mẫu, rồi cố định trong dung dịch Davidson. Kích thƣớc trứng đƣợc ghi nhận theo giai đoạn phát triển tế bào trứng.
- Xác định thời gian phát triển phôi: trứng cá từ lúc mới đƣợc đẻ ra cho đến khi nở đƣợc ghi lại hình ảnh 15 phút một lần bằng kính hiển vi chụp ảnh.
- Xác định tỉ lệ trứng thụ tinh: tỉ lệ trứng thụ tinh đƣợc xác định khi trứng đạt đến giai đoạn phôi vị.
(3) GSI (%) =
Tổng khối lƣợng cá bỏ nội quan (gam) Khối lƣợng tuyến sinh dục (gam)
x 100 %
F = nG/g (4)
(5) Sức sinh sản tƣơng đối =
Khối lƣợng cá cái Sức sinh sản tuyệt đối
22
- Phƣơng pháp xác định tỉ lệ trứng thụ tinh: trứng mới đƣợc đẻ ra thu 3 mẫu (mỗi mẫu 30 trứng) ấp trong điều kiện môi trƣờng thích hợp. Khi trứng đến giai đoạn phôi vị, đếm tổng số trứng thụ tinh, rồi tính theo công thức (6): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xác định tỉ lệ trứng nở theo công thức (7):
- Xác định các yếu tố môi trƣờng nƣớc nuôi:
Nhiệt độ đo bằng nhiệt kế bách phân, đo ngày 2 lần, buổi sáng 7 giờ và buổi chiều 15 – 16 giờ hoặc sử dụng máy đo đa chỉ tiêu 05M1635 (USA).
Oxy hòa tan đo định kỳ hàng tuần vào 7 giờ sáng và 15 - 16 giờ chiều bằng phƣơng pháp Winkler hoặc test oxy.
pH: đo định kỳ hàng tuần, thời gian đo vào lúc sáng 7 giờ và chiều 15 – 16 giờ bằng máy đo đa chỉ tiêu hoặc test pH.
2.3.4. Tập hợp và nuôi vỗ thành thục 2.3.4.1. Thuần dƣỡng cá bố mẹ 2.3.4.1. Thuần dƣỡng cá bố mẹ
- Cá bố mẹ Chạch lửa có nguồn gốc từ tự nhiên. Cá đƣợc nuôi thuần dƣỡng trong bể có thể tích 15m3, độ sâu 100cm. Sục khí, xi phông đáy và thay nƣớc hàng ngày.
Thức ăn cho cá Chạch lửa là thức ăn tƣơi sống (cá, tép bò, thức ăn viên công nghiệp), khẩu phần 3 - 5%. Mỗi ngày cho ăn 1 - 2 lần. Sau khi thuần dƣỡng thì chọn loại thức ăn phù hợp nhất cho cá.
- Cá Hổ có nguồn gốc tự nhiên, có 2 cỡ cá tập hợp:
+ Cỡ cá nhỏ: từ 20 - 30 gam/con, theo dõi sự tăng trƣởng của cá đến khi thành thục lần đầu.
+ Cỡ cá 0,2 kg - lớn hơn 1kg: nuôi vỗ để đón đầu sự thành thục của cá.
Cá đƣợc nuôi trong bể 15m3, mỗi bể thả nuôi 8 – 10 con (cá lớn) và 20 - 30 con/bể (cá cỡ nhỏ).
(6) Tỉ lệ thụ tinh (%) = Tổng số trứng thụ tinh / Tổng số trứng trong mẫu x 100
23
Thức ăn cho cá Hổ là thức ăn tƣơi sống (cá và tép bò), khẩu phần ăn 3- 5%/ngày (theo nhu cầu). Mỗi ngày cho ăn 1 - 2 lần. Sau khi thuần dƣỡng thì chọn loại thức ăn phù hợp nhất cho cá.
Các chỉ tiêu thủy hóa môi trƣờng (nhiệt độ, pH, oxy hòa tan) đƣợc theo dõi nhằm đảm bảo thích hợp cho hoạt động sống của cá.
2.3.4.2. Nuôi vỗ cá bố mẹ
- Cá Chạch lửa:
Sau khi nuôi thuần dƣỡng khỏang 1 tháng, tiến hành chọn bố mẹ đạt tiêu chuẩn nuôi vỗ trong bể có diện tích 15m3, độ sâu nƣớc 80 - 100cm. Cá đực và cái đƣợc nuôi chung, tỷ lệ 1/1, mật độ nuôi trong bể từ 1 – 1,5 kg/m3. Thức ăn cung cấp đầy đủ nhƣ giai đoạn thuần dƣỡng đã xác định.
Bể nuôi vỗ đƣợc sục khí, xi phông đáy và thay nƣớc hàng tuần.
Định kỳ hàng tháng kiểm tra đánh giá mức độ thành thục của cá bố mẹ.
Các giai đọan phát triển của tuyến sinh dục đƣợc xác định bằng phƣơng pháp xem trực tiếp trên trứng và làm tiêu bản mô học.
Theo dõi các chỉ tiêu về sinh sản (hệ số thành thục, sức sinh sản, tỷ lệ đẻ, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở…).
Các chỉ tiêu về môi trƣờng (nhiệt độ, pH, oxy hòa tan…) đƣợc kiểm tra mỗi ngày và định kỳ.
- Cá Hổ:
Nuôi trong bể xi măng 15m3, mật độ nuôi 0,5 - 1kg/m3. Thức ăn nhƣ giai đoạn nuôi thuần dƣỡng đã xác định phù hợp.
Xác định các chỉ tiêu sinh học sinh sản của cá nuôi vỗ:
Kiểm tra sự thành thục sinh dục của cá bố mẹ hàng tháng để đánh giá các chỉ tiêu sinh học sinh sản.
Hệ số thành thục đƣợc tính theo công thức (8): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: Ptsd là trọng lƣợng tuyến sinh dục (g) Po là trọng lƣợng cá bỏ nội tạng HSTT= (Ptsd/Po) 100 (8)
24
Sự phát triển noãn bào đƣợc đánh giá thông qua đƣờng kính trứng, đƣợc đo trên kính hiển vi soi nổi có vi mét thị kính với độ phóng đại 40. Trứng đƣợc lấy ở ba vị trí đầu, giữa và cuối của buồng trứng với số lƣợng 30 tế bào trứng/mẫu, rồi cố định trong dung dịch Davidson.
Tổ chức học buồng trứng đƣợc làm tiêu bản theo phƣơng pháp của Wallington (1967) và Kierman (1990). Quan sát và chụp ảnh mẫu tổ chức học buồng trứng dƣới kính hiển vi quang học Olympus.
2.3.5. Kích thích sinh sản 2.3.5.1. Chọn cá bố mẹ 2.3.5.1. Chọn cá bố mẹ
*Chọn cá đực:
Khi cá đã thành thục sinh dục, vuốt nhẹ hai bên lƣờn bụng hƣớng về lỗ sinh dục thì thấy có tinh dịch màu trắng đục chảy ra. Để có khả năng thụ tinh cao, nên kiểm tra độ vận động và mật độ tinh trùng dƣới kính hiển vi quang học. Chỉ sử dụng sẹ của những cá đực có tỉ lệ vận động của tinh trùng trên 80%.
* Chọn cá cái:
Cá cái khi thành thục sinh dục thì bụng to, mềm đều. Nếu cá lớn, có thể dùng que thăm trứng thu một ít trứng, cho vào đĩa petri kiểm tra và đánh giá các chỉ tiêu nhƣ màu sắc, độ đồng đều, độ lệch tâm của nhân và đƣờng kính trứng. Cá cái có trứng có màu vàng nhạt, đồng đều, nhân lệch tâm, là có thể chọn để kích thích sinh sản.
*Áp dụng phương pháp sinh sản nhân tạo vuốt khô:
Chọn cá cái và đực có sản phẩm sinh dục đạt giai đọan chín mùi, tiêm kích dục tố (KDT) / chất kích thích sinh sản (KTSS). Sau thời gian hiệu ứng thì cá cái sẽ rụng trứng. Vuốt trứng, vuốt tinh dịch và tiến hành thụ tinh nhân tạo. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 liều lƣợng KDT / Chất KTSS khác nhau và lặp lại 3 lần.
- Liều lƣợng các kích dục tố (KDT) và chất kích thích sinh sản (KTSS): Sử dụng 3 loại KDT và chất KTSS thông dụng hiện nay là:
+ HCG (Human Chorionic Gonadotropin). Đối với cá cái, liều lƣợng tổng cộng 2.500 - 3.500 - 4.500 UI/kg;
25
+ LH - RHa (Lutenizing Hormon Releasing hormone analog), liều lƣợng tổng cộng 100 – 150 – 200µg/kg + tƣơng ứng với 5 – 10 – 15mg Domperidon hoặc 1-2-3 viên Motilium (DOM) chứa lƣợng Domperidon tƣơng ứng.
+ Não thùy thể cá (não cá chép có nguồn gốc tại nơi nghiên cứu, bảo quản trong aceton ngay sau khi lấy não), liều lƣợng tổng cộng 4 – 6 – 8mg/kg.
- Các KDT/chất KTSS đƣợc tiêm theo phép tiêm dẫn (1/10 liều lƣợng tổng cộng), tiêm sơ bộ (với 1/4 liều lƣợng tổng cộng) và quyết định. Cá đực tiêm một lần cùng với lần tiêm quyết định của cá cái với liều lƣợng bằng 1/3 – 1/4 liều quyết định của cá cái.
- Trong sinh sản nhân tạo, trứng đƣợc vuốt rồi trộn với tinh dịch để tiến hành thụ tinh.
- Số lƣợng trứng cá đẻ ra đƣợc tính theo phƣơng pháp trọng lƣợng hoặc đếm trực tiếp toàn bộ số trứng thu đƣợc.
- Những chỉ tiêu theo dõi trong quá trình kích thích sinh sản nhân tạo bao gồm: + Thời gian hiệu ứng (giờ): đƣợc tính từ khi tiêm liều quyết định đến khi cá cái rụng trứng.
+ Tỉ lệ rụng trứng đƣợc tính theo công thức (9):
+ Thời gian phát triển phôi: trứng cá từ lúc mới đẻ ra và đƣợc thụ tinh cho đến khi nở đƣợc chụp hình 15 phút một lần dƣới kính hiển vi.
+ Tỉ lệ thụ tinh (%): trứng thụ tinh đƣợc xác định khi phát triển đến giai đoạn phôi vị. Trứng sau khi thụ tinh (3 mẫu, mỗi mẫu 100 trứng) đƣợc ấp riêng. Khi trứng phát triển đến giai đoạn phôi vị thì đếm tổng số trứng thụ tinh, rồi tính theo công thức (10): (9) Tỉ lệ rụng trứng (%) = Tổng số cá cái đƣợc tiêm Số cá cái rụng trứng 100 Tỉ lệ thụ tinh (%) = (số trứng thụ tinh/tổng số trứng) 100 (10)
26 + Tỉ lệ nở đƣợc tính theo công thức (11)
2.3.6. Ấp trứng
- Áp dụng phƣơng pháp ấp trứng dính trên giá thể, trứng đƣợc rải dính đều trên giá thể là một khung hình vuông kích thƣớc 30 x 30cm có gắn lƣới sợi cƣớc hoặc vải mùng thƣa. Khung lƣới có rải dính trứng đƣợc đặt nằm ngang trong nƣớc bể ấp composite hoặc trong khay nhựa. Trong quá trình ấp, cho nƣớc chảy nhẹ và sục khí để cung cấp đủ oxy. Khi trứng nở toàn bộ thì vớt giá thể ra.
- Theo dõi và ghi hình ảnh các giai đoạn phát triển phôi trên kính hiển vi.
2.3.7. Ƣơng cá bột lên cá hƣơng và giống cá Chạch lửa
- Ƣơng cá bột lên giống trong bể composite hoặc bể kính. Thí nghiệm đƣợc bố trí với các loại thức ăn: (1) Moina rồi đến trùn chỉ; (2) thức ăn chế biến; (3) thức ăn công nghiệp. Các thí nghiệm ƣơng lặp lại 3 lần.
Bảng 2.1. Các loại thức ăn khác nhau dùng ƣơng từ cá bột đến 60 ngày tuổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Loại thức ăn Ngày tuổi 1 – 10 Ngày tuổi 11 – 20 Ngày tuổi 21 trở đi