2.3.4. Nghiên cứu mối quan hệ giữa bệnh Greening và môi giới truyền bệnh (rầy chổng cánh Diaphorina cirtri Kuwayama)
2.3.5. Thử nghiệm một số biện pháp ựể chống tái nhiễm bệnh Greening trên ựồng ruộng
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. điều tra thực trạng sản xuất và tập quán canh tác cây cam, quýt tại Hoà An, Cao Bằng Hoà An, Cao Bằng
điều tra thực trạng sản xuất cũng như tập quán trồng cam, quýt của nông dân tại Hoà An theo phương pháp ựiều tra trực tiếp, phát phiếu ựiều tra và phỏng vấn.
2.4.2. điều tra thành phần sâu bệnh hại trên cây cam quýt tại Hoà An, Cao Bằng Bằng
*điều tra thành phần sâu bệnh hại trên cam quýt ựược tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1997)[12].
điều tra theo ựiểm cố ựịnh: điều tra ựược tiến hành ựịnh kỳ 15 ngày một lần trên các vườn cam quýt ựã chọn ựể nghiên cứu, ựiều tra tại 3 vườn, trên mỗi vườn ựiều tra tại 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 10 cây.
điều tra bổ sung: được tiến hành vào lúc cây ra lộc, ra hoa, ra quả hoặc theo từng ựợt sâu bệnh hại phát sinh rộ ở các vườn trồng cam quýt khác tại Hòa An.
Tất cả các mẫu sâu bệnh hại thu thập ựược phải ghi rõ dạng triệu chứng, bộ phận bị bệnh, nguồn cây giống, tuổi cây, ựiều kiện ựất ựai, ựịa phương thu thập, ngày ựiều tra.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
đối với các loài sâu hại: Thu thập mẫu sâu hại trong ựiểm ựiều tra. Xác ựịnh tên khoa học, dựa theo các tài liệu phân loại sẵn có và ựối chiếu với mẫu của Viện Bảo vệ thực vật.
đối với bệnh hại: Thu thập tất cả các mẫu triệu chứng liên quan ựến bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây, các mẫu bệnh thu thập ựược giữ trong túi giấy báo hoặc túi xi măng. Quan sát các vi sinh vật gây hại dưới kắnh hiển vi, ựịnh tên các loài nấm gây bệnh theo các tài liệu của Roger (1953), Ellis (1993) và so sánh với các mẫu bệnh trong bộ sưu tập bệnh cây của Viện Bảo vệ thực vật.
*Chỉ tiêu theo dõi: Thành phần sâu bệnh hại trên các vườn cam quýt ựiều tra
- Mức ựộ phổ biến của bệnh hại trên những vườn ựiều tra ựược ựánh giá theo thang 4 cấp sau:
+ : Tỷ lệ cây bị bệnh trên ựồng ruộng từ 1 Ờ 10% ++: Tỷ lệ cây bị bệnh trên ựồng ruộng từ 11 Ờ 20% +++: Tỷ lệ cây bị bệnh trên ựồng ruộng từ 21 Ờ 50% ++++: Tỷ lệ cây bị bệnh trên ựồng ruộng >50%
- Mức ựộ phổ biến của từng loại sâu hại trên vườn ựiều tra. Tổng số ựiểm có loài sâu hại cần xác ựịnh
độ bắt gặp(%) = --- x 100% Tổng số ựiểm ựiều tra
Mức ựộ phổ biến: + : Ít phổ biến (ựộ bắt gặp < 20%) ++: Phổ biến (ựộ bắt gặp từ 20 - 50%) +++: Rất phổ biến (ựộ bắt gặp > 50%)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
* Phương pháp chẩn ựoán bệnh vàng lá Greening bằng kỹ thuật PCR của Hong Ji Su gồm 5 bước
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và các hoá chất cần thiết
Mẫu sau khi thu thập ựược rửa dưới vòi nước nhằm làm sạch các vết bẩn và các hoạt chất sau khi phun thuốc trừ sâu, bệnh hại ựể làm tăng khả năng phản ứng PCR.
Bước 2: Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ lá, vỏ cành
Thu thập mẫu và tách lấy gân lá và vỏ cành. Cân 0,5 gam mẫu, nghiền với 3ml dung dịch chiết(DNA-Extraction buffer: 100mM Tris Ờ HCl, 100 mM EDTA, 250Mm NaCl) và 0,3ml Sakosyl 10%. Lấy 1,5ml dịch nghiền vào eppendoft 1.6ml giữ ấm trong 55oC từ 1 ựến 2 giờ ựồng hồ.
Ly tâm dung dịch chiết ựã ủ ấm 55oC ở tốc ựộ 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 0,8ml dung dịch phắa trên cho vào eppendoft khác, thêm vào 100 ộl dung dịch 5M NaCl và 100 ộl CTAB 0.7M có tác dụng loại bỏ cacbamat và làm mỏng các màng tế bào, tạo ựiều kiện tốt cho việc thu ADN, ựặt ở 650C trong 10 phút.
Thêm vào ựó 0,6ml Chloroform/Isoamyl alcol (24:1) lắc mạnh, ly tâm 11.000vòng/phút trong 5 phút.
Chuyển 0,8ml dung dịch phắa trên sang một ống eppendoft khác và thêm 0,6ml Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc mạnh cho ựến lúc dung dịch biến thành màu sữa rồi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
Lấy 0,6ml dung dịch phắa trên cho vào eppendoft khác rồi thêm 360ộl Isopropanol lắc nhẹ, có thể giữ ở nhiệt ựộ -20oC ắt nhất 2 giờ hoặc qua ựêm.
Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút ựể thu ựược kết tủa. Rửa sạch viên kết tủa bằng cồn 70o rồi làm khô bằng máy hút chân không.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Làm tan viên kết tủa bằng 100ộl dung dịch TE buffer pH 8.0( và cất giữ ở nhiệt ựộ âm 20oC dùng làm ADN khuôn mẫu.
Bước 3: Nhân ADN bằng phương pháp PCR
Các hoá chất dùng cho phân tắch một mẫu bệnh greening bao gồm: Nước cất 2 lần ựã khử trùng 14,75 ộl 10X Taq buffer 2,5 ộl 50 mM MgCl2 2,0 ộl 2.5 mMdNTPs 2,0 ộl Primers 1,0 ộl Taq polymerase 0,25 ộl Template DNA 2,5
Tổng dung dịch pha PCR/mẫu 25 ộl
Cho 22 ộl dung dịch ựã pha ở trên vào tuýp PCR rồi thêm 3ộl ADN khuôn mẫu ựã tinh sạch ở bước 1. Lập trình chạy PCR.
Chu kỳ của phản ứng PCR gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm có 3 bước. Bước 1: 94oC trong 3 phút
Bước 2: 94oC trong 1, phút 60oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút Bước 3: 72oC trong 10 phút có tác dụng tổng hợp sợi ADN
Bước 4:Chạy ựiện di
Nồng ựộ agarose ựể làm gen là 1,4%. Lấy 10ộl sản phẩm PCR ựã hoàn thành cộng với 2ộl loading buffer, trộn ựều và nhỏ vào một giếng cho một mẫu.
Chạy ựiện di ở dòng ựiện 110 Vol, chạy theo chiều từ cực âm sang cực dương bằng dung dịch TBE pH 8.0.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Bước 5:Phân tắch kết quả dưới ựèn cực tắm
Ngâm miếng gen ựã chạy ựiện di trong dung dịch Ethidium bromide nồng ựộ 3% ở khoảng thời gian 3 - 5 phút. Sau ựó ngâm, rửa ở trong nước cất 5 phút và kiểm tra kết quả.
Dựa vào thang chuẩn của dung dịch marker và mẫu ựối chứng ựể kiểm tra kết quả. Dùng ựoạn mồi của GS. Hong Ji Su, sản phẩm sẽ ở ựoạn 228bp.
* Dung dịch chiết(DNA-Extraction buffer) : 100mM Tris Ờ HCl; 100 mM EDTA; 250Mm NaCl).
* TE buffer (pH 8.0): 10mMTris, 1mM EDTA
* Loading buffer: 0,25 brommophenol blu, 30 glycerol pha với tỷ lệ 1:4
* Phương pháp chẩn ựoán vi khuẩn Liberobacter trong cơ thể rầy bằng kỹ thuật PCR gồm 5 bước
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và các hoá chất cần thiết
Rầy sau khi thu thập ựược ựặt trong dung dịch chiết.
Bước 2: Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ rầy
Lấy 01 rầy nghiền với 200ộl dung dịch chiết và 30ộl Sakosyl 10%. trong eppendoft giữ ấm ở 55oC trong 1 ựồng hồ.
Thêm vào ựó 200 ộl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc mạnh và ly tâm ở tốc ựộ 12.000vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 200 ộl dung dịch phắa trên cho vào eppendoft khác, thêm vào 500ộl dung dịch EtOH 95~100% lắc nhẹ và giữ ở nhiệt ựộ -20oC trong 30 phút.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ựể thu ựược kết tủa, rồi làm khô bằng máy hút chân không trong 10 phút.
Làm tan viên kết tủa bằng 50ộl dung dịch TE buffer pH 8.0 và cất giữ ở nhiệt ựộ âm 20oC dùng làm ADN khuôn mẫu.
Từ bước 3 trở ựi thực hiện giống như làm với mẫu phân tắch trong lá cây bị bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
* Phương pháp chẩn ựoán nhanh bệnh Greening trên ựồng ruộng bằng kit Iodine
Thu thập những lá có triệu chứng bị vàng trên ựồng ruộng và bảo quản trong túi nilon. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng miếng giấy ráp 1 x 2cm chà lên bề mặt trên của lá vừa thu thập ựược.
Miếng giấy ráp vừa thu ựược cho vào một túi nilon có chứa 1ml nước tinh khiết và sử dụng lượng nước ựó ựể rửa miếng giấy ráp vừa chà sát trên bề mặt lá.
Cho 2 giọt dung dịch Iodine vào dung dịch vừa thu ựược, trộn ựều bằng tay. Quan sát sự biến mầu của của dung dịch khi cho Iodine vào, mẫu bị bệnh sẽ biểu hiện màu ựen hoặc nâu ựen, mẫu không bị bệnh greening sẽ giữ nguyên màu vàng của thịt lá.
* Phương pháp giám ựịnh bệnh Tristeza bằng que thử phản ứng
Bước 1: Chuẩn bị dịch mẫu (Kháng nguyên)
Mẫu thu thập về ựược rửa sạch, tách gân rồi cân 0,5g/mẫu. Nghiền mẫu trong 3ml dung dịch nghiền ựặc hiệu, ly tâm nhẹ ựể gạn lấy 0,5ml phần dịch trong vào ống tuýp 1,7.
Bước 2: Tạo phản ứng
Cắm vào mỗi ống tuýp 1 que phản ứng. đợi khoảng 30 giây ựến 3 phút, khi que thử ở mẫu ựối chứng bệnh xuất hiện 2 vạch màu nâu rõ rệt và các mẫu khác xuất hiện 1 hoặc 2 vạch nâu là kết luận phản ứng.
Bước 3: Kết luận
Que thử ở mẫu ựối chứng bệnh xuất hiện 2 vạch màu nâu và que thử ở mẫu ựối chứng khoẻ xuất hiện 1 vạch nâu: Phản ứng tốt
Que thử ở mẫu kiểm tra nào xuất hiện 2 vạch như ựối chứng bệnh là những mẫu nhiễm bệnh, que thử chỉ xuất hiện 1 mạch như ựối chứng khoẻ là những mẫu không nhiễm bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45