Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn và được lặp đi lặp lại nhiều lần:
Giai đoạn biến tính (denaturation):
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-95°C trong vòng 30-60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme DNA polymerase xúc tác tổng hợp [2].
Giai đoạn lai (hybridization):
Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70°C tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây [3].
Giai đoạn tổng hợp (elongation):
Nhiệt độ được tăng lên đến 72°C giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Một phản ứng thường có từ 25-35 chu kỳ. Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho mỗi phản ứng PCR. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312nm) [2].
Hình 1.5. Phản ứng PCR 1.7.3. Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng nhiều kỹ thuật chuẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Việc giảm lượng mẫu ban đầu hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn [2].
- Enzyme
Enzyme được sử dụng lần đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Phương pháp PCR đã chuyển sang một bước ngoặt mới từ khi phát hiện ra enzyme chịu nhiệt được tách từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này là – Taq polymerase – không bị phá hủy bởi nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối phản ứng [2].
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với năng suất và chức năng phản ứng khác nhau (bảng 1.5) và dần chuyên biệt hơn.
Bảng 1.5. Các enzyme thường sử dụng trong phản ứng PCR
Enzyme Sinh vật Độ chính xác Hiệu suất Độ ổn định
Taq T aquaticus Thấp cao Thấp
Tbr T brockianus Thấp Thấp Cao
Tli T litoralis
Cao Thấp Rất cao
Deep Vent P GB-D
Cao Thấp Rất cao
- Mồi (Primer) và nhiệt độ lai
Là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuyếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:
Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và “mồi ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
Tm của “mồi xuôi” và “mồi ngược” không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần.
Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 3 kb (sản phẩm PCR)
Nồng độ mồi trong một phản ứng PCR thường từ 0.1 - 0.5 mM hoặc 6x1012 phân tử hoặc hơn, nồng độ này đủ cho ít nhất 30 chu kỳ
Kích thước mồi khoảng 20 bp và chứa đủ 4 base bằng nhau (17 – 30 bp hoặc hơn) [2].
- Các thành phần khác của phản ứng PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bốn loại deoxynucleotide triphosphate (dCTP, dATP, dGTP. dTTP) thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn sẽ
dẫn đến sự ức chế phản ứng PCR. Mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. Bốn loại dNTPs này thường được trộn lẫn với nhau và giữ ở dạng chất lỏng ở -20°C [2].
Tất cả enzyme polymerase đều yêu cầu cation hóa trị 2 để hoạt động. Thường là Mg++, Mg++ liên kết với cả primer và dNTPs và lượng Mg++ tự do phải đủ để liên kết với enzyme. Do vậy, lượng Mg++ phụ thuộc vào nồng độ dNTPs và DNA (thông thường là 1,5mM). Cation hóa trị một thường là K+ khoảng 50mM.
Đệm Tris ở pH 8.3 hoặc hơn thường được sử dụng. Khi nhiệt độ phản ứng tăng lên 70°C trong quá trình polymerization, pH của đệm Tris giảm xuống khoảng 7.
- Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Kết quả sau n chu kỳ của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Số lượng chu kỳ của một phản ứng phụ thuộc vào:
Lượng mẫu DNA ban đầu của phản ứng Hiệu quả của phản ứng
Một phản ứng thường có từ 25-35 chu kỳ. Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho mỗi phản ứng PCR [2].
- Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các ống nghiệm dùng cho phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này ảnh hưởng rất lớn đến quá trình khuếch đại [2].
1.7.4. Phương pháp phân tích kết quả PCR
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử tuỳ thuộc vào tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của chính các phân tử này. Như vậy giữa các phân tử có cùng điện tích, phân tử nào có khối lượng lớn hơn sẽ di chuyển về cực ngược dấu chậm hơn.
Acid Nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm vì vậy chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường. Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển trên gel càng chậm. Vì vậy tuỳ theo kích thước phân tử và tuỳ theo mức độ cần phân tách mà người ta chọn loại gel và nồng độ gel thích hợp để dùng trong điện di [2].
Có hai loại gel thường dùng trong điện di là:
Gel agarose: Thích hợp trong phân tích các DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10000 cặp base. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
Gel polyacrylamide: Thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn có kích thước dưới 500bp. Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai phân tử DNA chỉ sai khác nhau 1 nucleotide.
Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng Ethidium bromide (C21H20BrN3). Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của các phân tử DNA. Do đó các phân tử DNA sẽ gắn kết với Ethidium bromide và phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vệt huỳnh quang này người ta biết vị trí các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay bằng các đầu đọc tử ngoại chuyên biệt.
Dựa vào kích thước đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thước các phân tử cần kiểm tra [2].
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
10 chủng vi khuẩn C. perfringens type D phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử do Bộ môn nghiên cứu Vi Trùng cung cấp.
2. 2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Nghiên Cứu Vi Trùng, Phân Viện Thú Y Miền Trung, Km 4, đường 2/4, phường Vĩnh Hòa, Tp Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa.
- Thời gian nghiên cứu : Từ ngày 15/03 đến ngày 15/06 năm 2011.
2.3. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
- Môi trường nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn:
+ Môi trường Fluid thioglycolate, SPS agar (Perfringens Slection Agar), Thạch máu, Egg yolk, Litmus milk, Manitol- motility, và các môi trường đường (Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose).
- Dung dịch hoá chất: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thuốc nhuộm Gram ( Crystal violet, Lugol, Ethanol, Fuchsin).
+ Dung dịch hoá chất dùng cho phản ứng PCR: PCR- buffer 10X; MgCl2; dNTPs; enzyme Taq DNA- polymerase; Dnase- free water; DNA khuôn mẫu; Q solution 5X; Cặp mồi đặc hiệu với gene mã hóa epsilon toxin.
- Động vật thí nghiệm:
+ Chuột nhắt trắng khỏe mạnh có trọng lượng từ 18 – 20 g. + Dê khỏe mạnh 9-12 kg
- Một số máy móc thiết bị: Hộp lồng, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, giá ống nghiệm, nồi hấp, tủ ấm, tủ ấm CO2, tủ lạnh, tủ sấy, bộ nuôi yếm khí, máy ly tâm, máy luân nhiệt PCR, bể điện di, máy đọc gel…
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Giám định một số đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn C. perfringens theo phương pháp của Quinn P.J. và cộng sự (1994) [34]. perfringens theo phương pháp của Quinn P.J. và cộng sự (1994) [34].
Phương pháp mở giống
Chủng C. perfringens type D dạng đông khô, bảo quản ở nhiệt độ - 80°C được tiến hành rã đông ở nhiệt độ thường. Sau đó cấy tăng sinh trên môi trường Fluid thioglycolate, nuôi cấy 18-24 giờ trong điều kiện yếm khí (CO2 10%, 37°C).
Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu
Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ canh khuẩn trên môi trường Fluid thioglycolate ria đều trên bề mặt thạch máu. Sau đó ủ ở 370C trong điều kiện yếm khí. Sau 24 giờ đọc kết quả, nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết thì phản ứng dương tính và ngược lại.
Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn C. perfringens bằng phương pháp soi tươi
Làm tiêu bản giọt treo: Cho một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid thioglycolate lên giữa la-men. Rồi lấy vaselin chấm vào 4 góc lamen, đặt phiến kính lõm áp vào la-men (không để giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm).Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi ở vật kính dầu (X100).
Kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu của C. Perfringens
Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram. Dùng que cấy vòng lấy một ít canh khuẩn từ môi trường Fluid thioglycolate dàn đều lên bề mặt lam kính. Cố định tiêu bản bằng cách hơ lam kính 2-3 lần qua ngọn lửa đèn cồn. Sau đó tiến hành nhuộm:
Bước 1: Phủ lên tiêu bản dung dịch Crystal Violet trong 1 phút, sau đó rửa nhẹ bằng nước.
Bước 2: Phủ lên tiêu bản dung dịch Lugol trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước.
Bước 3: Dùng cồn 95% nhỏ từ từ lên tiêu bản rồi nhanh chóng rửa lại bằng nước ( thời gian tẩy chỉ khoảng 5-10 giây)
Bước 4: Phủ lên tiêu bản dung dịch Fuchsin trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước.
Để cho tiêu bản khô và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu (X100).
Xác định khả năng lên men đường Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, nuôi cấy trong tủ ấm 370C, 10% CO2. Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại.
Kiểm tra khả năng sinh hơi
Vi khuẩn có khả năng sinh hơi trên các môi trường đường, nếu thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên và ngược lại.
Kiểm tra khả năng di động trên môi trường Mannitol – Motility
Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy, vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Litmus milk
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong tủ ấm 370C, 10% CO2, sau 24 – 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn lên men Lactose, làm đông vón Casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH litmus.
Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Egg yolk
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Nuôi cấy ở điều kiện yếm khí, đặt trong tủ ấm 370C sau 24 -28 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc và ngược lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CAMP – test
Đánh giá khả năng hình thành nhân tố β – hemolysin gây nên hiện tượng dung huyết trên môi trường thạch máu nhờ phospholipase C của vi khuẩn
C.perfringens.
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc Streptococcus agalactiae cấy thành một đường ngang trên đĩa. Trên vùng đĩa rộng, cấy chủng vi khuẩn C. perfringens thành đường thẳng vuông góc với đường cấy ban đầu, không để cho 2 đường cấy này giao với nhau.
Thử nghiệm là dương tính khi có sự hình thành vùng dung huyết hình mũi tên tại vùng tiếp giáp giữa đường cấy của chủng C. perfringens và Streptococcus agalactiae. Ngược lại, không có vùng dung huyết tại vùng tiếp giáp như trên là âm tính.
2.4.2. Xác định gen mã hóa độc tố epsilon bằng phản ứng PCR
Kiểm tra gen mã hóa độc tố epsilon của vi khuẩn C.perfringens bằng phản ứng PCR theo phương pháp của Songer và cộng sự (1999) [38].
Tách chiết DNA
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA, gồm 3 bước sau: - Bước 1: Hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluid thioglycolate) cho vào ống eppendorf. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút ở 4°C. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn.
- Bước 2: Thêm 200 µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn, rồi tiến hành đồng nhất mẫu. Đun cách thủy ở 100°C trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông của tủ lạnh (4 - 8°C) trong thời gian 5 phút.
- Bước 3: Ly tâm ở 4°C, tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 4 phút. Thu dịch nổi có chứa DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR. Sau đó DNA được bảo quản ở 4 - 8°C.
Phản ứng PCR
Bảng 2.1.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút)
Giai đoạn 1 1 94 5 94 1 55 1 Giai đoạn 2 30 72 1 Giai đoạn 3 1 72 10 94°C 94°C 5 phút 55°C 72°C 72°C 4°C 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút ∞ 30 chu kỳ
Các thành phần tham gia phản ứng PCR Bảng 2.2.Thành phần tham gia phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) 1 PCR buffer 10X 2 2 MgCl2 25mM 1 3 dNTPS 2,5 1 4 Qsolution 5X 1 5 Etx - F 10 pmol 0,25 6 Etx - R 10 pmol 0,25 7 Taq DNA - polymerase 5U/µl 0,1
8 DNase – free water 16,4
9 DNA khuôn mẫu 3
Tổng thể tích 25
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Bảng 2.3.Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Gene Mồi Trình tự mồi Kích thước sản
phẩm PCR(bp)
Etx- F 5’GCGGTGATATCCATCTATTC 3’
Etx
Etx -R 3’ CCACTTACTTGTCCTACTAAC 5’ 655