Kiểm tra gen mã hóa độc tố epsilon của vi khuẩn C.perfringens bằng phản ứng PCR theo phương pháp của Songer và cộng sự (1999) [38].
Tách chiết DNA
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA, gồm 3 bước sau: - Bước 1: Hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluid thioglycolate) cho vào ống eppendorf. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút ở 4°C. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn.
- Bước 2: Thêm 200 µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn, rồi tiến hành đồng nhất mẫu. Đun cách thủy ở 100°C trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông của tủ lạnh (4 - 8°C) trong thời gian 5 phút.
- Bước 3: Ly tâm ở 4°C, tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 4 phút. Thu dịch nổi có chứa DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR. Sau đó DNA được bảo quản ở 4 - 8°C.
Phản ứng PCR
Bảng 2.1.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút)
Giai đoạn 1 1 94 5 94 1 55 1 Giai đoạn 2 30 72 1 Giai đoạn 3 1 72 10 94°C 94°C 5 phút 55°C 72°C 72°C 4°C 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút ∞ 30 chu kỳ
Các thành phần tham gia phản ứng PCR Bảng 2.2.Thành phần tham gia phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) 1 PCR buffer 10X 2 2 MgCl2 25mM 1 3 dNTPS 2,5 1 4 Qsolution 5X 1 5 Etx - F 10 pmol 0,25 6 Etx - R 10 pmol 0,25 7 Taq DNA - polymerase 5U/µl 0,1
8 DNase – free water 16,4
9 DNA khuôn mẫu 3
Tổng thể tích 25
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Bảng 2.3.Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Gene Mồi Trình tự mồi Kích thước sản
phẩm PCR(bp)
Etx- F 5’GCGGTGATATCCATCTATTC 3’
Etx
Etx -R 3’ CCACTTACTTGTCCTACTAAC 5’ 655
Phân tích kết quả PCR
- Chuẩn bị thạch: Cân 1,5 gam agarose cho vào 100ml đệm TBE rồi cho hỗn hợp đó vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng trong 5 phút để làm nóng chảy agarose.
- Đổ gel: Lấy bể điện di ra cài lược và các thanh chắn vào. Để nguội gel đến khoảng 50°C rồi bổ xung 5µl thuốc nhuộm Ethydium bromide đã lắc đều vào. Đổ gel vào bể điện di. Sau 20 phút gel đông lại, rút răng lược ở bể điện di ra sẽ được một dãy các giếng.
- Điện di: Hút 7µl maker cho vào giếng 1, hút 10µl mẫu đối chứng dương (mẫu DNA chuẩn được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn nghiên cứu Vi
trùng, Phân Viện Thú Y Miền Trung) cho vào giếng 2, hút 10µl mẫu đối chứng âm (thay DNA mẫu bằng nước siêu sạch) cho vào giếng 3, các giếng sau lần lượt cho 10µl các mẫu đã chạy PCR.
- Đọc kết quả: Sau khi điện di, gel được soi qua tia cực tím (UV) và chụp ảnh bằng máy đọc gel kết nối với máy tính.
2.4.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon trên động vật thí nghiệm
2.4.3.1. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene Etx trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của Miserez và cộng sự (1998) [26].
Vi khuẩn được nuôi cấy Fluid Thioglycolate trong điều kiện yếm khí (95%N2, 5 % CO2) ở 37oC sau 8 – 12 giờ, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 25 phút ở 4oC, bỏ phần cặn, lấy phần nước trong ở trên, xử lý với dung dịch trypsin 0,25%, ủ ở 37oC trong 30 phút. Mỗi chủng tiêm cho 2 chuột, mỗi con tiêm 0,3 ml vào đường tĩnh mạch đuôi. Theo dõi số lượng và thời gian chuột chết. Chuột đối chứng được tiêm 0,3 ml nước lọc môi trường xử lý với dung dịch trypsin 0,25%. Nếu trong dịch ly tâm canh khuẩn C. perfringens type D có tiền độc tố epsilon sẽ được trypsin hoạt hóa và gây độc đối với chuột.
2.4.3.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene Etx trên dê theo phương pháp của Uzal và cộng sự (2002) [39].
Sau khi thu hoạch độc tố, xử lý trypsin 0,25%. Tiến hành gây nhiễm trên dê với các liều từ 6,5 MLD của chuột/ kg thể trọng (dê) bằng đường tĩnh mạch. Theo dõi các triệu chứng lâm sàng sau khi gây nhiễm. Mổ khám kiểm tra bệnh tích. Liều MLD của chuột bằng 0,125 ml độc tố nguyên/chuột.(số liệu của bộ môn Nghiên Cứu Vi Trùng cung cấp). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.3. Tiêm độc tố vào tĩnh mạch cổ trên dê
Hình 2.4. Mổ khám kiểm tra bệnh tích 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học. Số mẫu dương tính
Tỷ lệ dương tính = X 100
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI
KHUẨN C. Perfringens
Để giám định đặc tính sinh vật, hóa học của 10 chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở 3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận, chúng tôi tiến hành nuôi cấy kiểm tra trên các môi trường Fluid thioglycolate, SPS agar (Perfringens Slection Agar), Thạch máu, Egg yolk, Litmus milk, lên men đường Glucose, Lactose, Mantose, Saccharose...Theo phương pháp của Quinn và cộng sự (1994) [34].
3.1.1. Kết quả kiểm tra hình thái của vi khuẩn C . perfringens
Các chủng vi khuẩn được làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu thuốc nhuộm soi trên kính hiển vi. Kết quả quan sát cho thấy, tất cả 10 chủng vi khuẩn C. perfringens kiểm tra đều bắt màu thuốc nhuộm Gram dương. Qua quan sát nhận thấy 10 chủng này là trực khuẩn, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc song song, một số kết thành chuỗi ngắn.
Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens soi trên kính hiển vi 3.1.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi
Kết quả kiểm tra bằng phương pháp soi tươi trên kính hiển vi cho thấy: Tất cả 10 chủng kiểm tra đều có dạng hình que ngắn, và không di động.
Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi 3.1.3. Đặc tính nuôi cấy
Trên môi trường Fluid thioglycolate: vi khuẩn C. pefringens phát triển tốt ở 370C, 10% CO2. Sau 24h nuôi cấy vi khuẩn mọc làm đục môi trường, và sinh nhiều bọt khí.
Dương tính
Đối chứng
Hình 3.3. Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Fluid thioglycolate Trên môi trường SPS: Sau 24h nuôi cấy yếm khí (370C, 10% CO2) trên đĩa thạch SPS, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn màu đen (do vi khuẩn sinh H2S, khí này tác dụng với Fe có sẵn trong môi trường tạo thành FeS có màu đen).
Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS.
Trên môi trường thạch máu: Sau 24h nuôi cấy yếm khí (370C, 10% CO2) trên đĩa thạch máu, vi khuẩn phát triển tạo thành khuẩn lạc tròn, nhẵn và bóng, được bao bọc bởi một vòng dung huyết hoàn toàn bên trong do độc tố theta, và một vòng dung huyết không hoàn toàn bên ngoài do độc tố beta (dưng huyết beta).
Hình 3.5. khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 3.1.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens
Chúng tôi tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa dựa trên các phản ứng hóa học tạo ra các sản phẩm trung gian trên các loại môi trường đường đơn và các môi trường đặc hiệu. Kết quả thu được như sau:
Khả năng lên men đường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên môi trường Mannitol-motility: 100% các chủng kiểm tra đều không có khả năng di động (vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy) và không lên men Mannitol.
Trên môi trường đường đơn: Sau 24 - 28 giờ nuôi cấy 100% các chủng vi khuẩn kiểm tra trên các môi trường đường (Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose) đều phát triển làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng. Vi khuẩn sử dụng đường tạo thành các sản phẩm trung gian có tính axit làm giảm pH của môi trường chuyển sang màu vàng với chỉ thị Phenol red. Và trên tất cả các môi trường đều xuất hiện vết thạch nứt, vỡ chứng tỏ tất cả các chủng kiểm tra đều có khả năng sinh hơi.
Đối chứng Glucose (+) Saccharose(+) Maltose(+) Lactose(+) Manitol (-)
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra lên men đường Trên môi trường Litmus milk
Vi khuẩn C. perfringens được nuôi cấy trong môi trường Litmus milk sau 24 - 28 giờ trong tủ ấm 370C, 10% CO2, tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều phát triển, lên men đường Lactose, làm đông vón Casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu sang trắng với chỉ thị pH Litmus.
Đối chứng Dương tính
Trên môi trường Egg yolk (lòng đỏ trứng gà)
Sau 24 – 28h nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở 370C, 10%CO2) tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều phát triển sinh men Lecithinase phân giải Lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
Hình 3. 8. Khuẩn lạc C.perfringens trên môi trường Egg yolk CAMP – test
100% các chủng kiểm tra sau 18 - 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí có phản ứng dương tính đối với phản ứng CAMP (xuất hiện dung huyết hình mũi tên trên bề mặt thạch). Nhân tố protein được tiết ra bởi loài Streptococus agalactiae có vai trò tăng cường hoạt tính của alpha toxin và theta toxin (có vai trò trong việc gây ra hiện tượng dung huyết). Do đó tăng cường điều kiện tiếp xúc và xúc tác thủy phân thành phần chủ yếu của màng hồng cầu là sphingomyelin, làm hồng cầu trở nên dễ vỡ, tạo nên hiện tượng dung huyết mạnh hơn ở vùng tiếp xúc giữa hai đường cấy của hai loại vi khuẩn.
Hình 3.9. Kết quả CAMP – test
Hình 3.9. Kết quả CAMP - test
Streptococus agalactiae C .p e rf ri n g e n s
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens có thể tóm tắt ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens
Tính chất Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính
Tỷ lệ (%) dương tính
Lên men Glucose 10 10 100
Lên men Lactose 10 10 100
Lên men Maltose 10 10 100
Lên men Saccharose 10 10 100
Lên men Mannitol -
motility 10 0 0
Egg yolk 10 10 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Litmus milk 10 10 100
SPS (Khuẩn lạc đen) 10 10 100
Thạch máu (dung huyết 2
vòng) 10 10 100
Fluid thioglycolate 10 10 100
CAMP-test 10 10 100
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy tất cả các chủng giám định đều mang đầy đủ các đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn C. perfringens như các tài liệu đã công bố.
3.2. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ETX BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHƯƠNG PHÁP PCR
Độc tố epsilon toxin được sinh ra bởi C. perfringens type D và type B. Gene mã hóa cho độc tố ETX gọi là etx [20]. Để giám định gene etx mã hóa độc tố ETX chúng tôi tiến hành bằng cách sử dụng phương pháp PCR.
Để giám định gene mã hóa độc tố ETX chúng tôi tiến hành chạy PCR 10 chủng C. perfringens type D cần kiểm tra theo phương pháp của Songer và cộng sự (1999) [38]. Kết quả giám định gen mã hóa độc tố ETX bằng kỹ thuật PCR thu được hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả giám định gene mã hóa độc tố ETX bằng phản ứng PCR
(- ): Đối chứng âm (+) : Đối chứng dương M : Thang chuẩn
Từ hình 3.10 ta nhận thấy 100% số chủng kiểm tra đều mang gene etx mã hóa cho độc tố ETX. Điều này chứng tỏ độc tố epsilon do C. perfringens type D sinh ra là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm ruột hoại tử trên dê. Kết quả của chúng tôi đã trùng với kết quả nghiên cứu của Miyashiro và cộng sự (2007) [27].
3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA EPSILON TOXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM
Để kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon toxin của 10 chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ dê, cừu mắc bệnh viêm ruột hoại tử chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn, chiết xuất tiền độc tố, hoạt hóa trypsin và gây nhiễm trên động vật thí nghiệm theo phương pháp của Miserez và cộng sự (1998) [26], Uzal và cộng sự (2004) [39].
3.3.1. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng
Chúng tôi chọn 10 chủng C. perfringens type D đã kiểm tra mang gen mã hóa độc tố epsilon để tiến hành nuôi cấy, chiết tách độc tố bằng cách ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong thời gian 25 phút, thu phần dịch nổi, xử lý bằng trypsin 0,25% trong 30 phút ở 37oC và tiêm cho chuột theo phương pháp đã mô tả. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện của độc tố epsilon trên chuột nhắt trắng được trình bày ở bảng 3.2.
Etx
Bảng 3.2 Kết quả biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng Chủng vi khuẩn Type độc tố Số lần thí nghiệm Số chuột tiêm/lần (con) Liều tiêm (ml) Số chết/số tiêm (con/con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) 33 D 3 2 0,3 6/6 100 2 34 D 3 2 0,3 6/6 100 2-3 42 D 3 2 0,3 6/6 100 5 59 D 3 2 0,3 6/6 100 2-4 66 D 3 2 0,3 6/6 100 2-4 135 D 3 2 0,3 6/6 100 2-4 136 D 3 2 0,3 6/6 100 1-2 143 D 3 2 0,3 6/6 100 4-5 KH D 3 2 0,3 6/6 100 3-4 162 D 3 2 0,3 6/6 100 2-4 Đối chứng - 3 2 0,3 0/6 0 -
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy độc tố của tất cả các chủng kiểm tra sau khi được xử lý với trypsin đều giết chết chuột trong vòng 2 đến 5 giờ bằng đường tiêm tĩnh mạch với các triệu chứng thần kinh như: Uốn vặn chân sau và đuôi; quay vòng; co giật trước khi chết.
Tất cả chuột chết đều tiến hành mổ và kiểm tra bệnh tích, kết quả cho thấy: Phổi sưng huyết, gan, ruột tụ huyết, xuất huyết.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước. Theo Nguyễn Văn Sửu (2003) [10] các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bê, nghé bị tiêu chảy tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc có độc lực mạnh, gây chết chuột trong vòng 24 giờ sau khi tiêm (tỷ lệ 70,77%). Theo Nguyễn Quang Tính (2007) [12] tỷ lệ giết chết chuột bạch của các chủng type A và type D phân lập từ dê ở Thái Nguyên là 93,64%. Theo Quinn và cộng sự (1999) [34], để chứng minh độc tố của C. perfringens có thể tiêm dịch lọc canh khuẩn nuôi cấy vi khuẩn vào tĩnh mạch cho chuột và chuột sẽ chết trong vòng 10 giờ (nếu chuột chết trong vòng 5 phút là do bị shock).
3.3.2. Kết quả kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon toxin trên dê
Để kiểm tra khả năng biểu hiện của độc tố epsilon trên dê chúng tôi sử dụng phương pháp của Uzal và cộng sự (2004) [39]. Chọn vi khuẩn C. perfringens type D chủng 135 để tiến hành kiểm tra. Kết quả nghiên cứu của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng cho thấy liều MLD của C. perfringens type D chủng 135 là 0,125 ml độc tố nguyên/chuột. Để kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon, chúng tôi tiến hành tiêm tĩnh mạch cho dê với liều 6,5 và 7 MLD chuột/ Kg trọng lượng dê. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên dê
Động vật Liều (MLD chuột/kgP) Số tiêm (con) Đường
tiêm Triệu chứng sau khi gây nhiễm
6,5 1 TM
Sau 1 giờ gây nhiễm dê bắt đầu có triệu chứng: ủ rũ, ăn ít, sốt (39,5oC): run rẩy, húc đầu vào tường, co giật, nằm liệt và chết sau 8 giờ gây nhiễm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dê
7 1 TM
Sau 30 phút dê ủ rũ, ăn ít, sốt nhẹ, run rẩy, đi vòng tròn sau đó co giật, nằm liệt và chết sau 1 giờ gây nhiễm.
Từ kết quả phân tích ở bảng cho thấy chủng kiểm tra biểu hiện của epsilon trên dê đã gây chết dê. Với liều 6,5 MLD chuột/ kg trọng lượng dê, độc tố đã gây ra các triệu chứng ngộ độc thần kinh sau 1 giờ và giết chết dê sau 8 giờ gây nhiễm bằng đường tĩnh mạch. Với liều 7 MLD chuột/ kg trọng lượng dê, độc tố đã gây ra các triệu chứng ngộ độc thần kinh sau 30 phút và giết chết dê sau 1 giờ gây nhiễm bằng đường tĩnh mạch.