- Phương pháp thu thập và xử lý thông tin được truy cập từ các kênh thông tin trong và ngoài nước vềđặc điểm thực vật học, phân loại, phân bố của loài cây thuốc quý; các công nghệ và thiết bị sản xuất các giống cây quý hiếm in vitro và in vivo
- Phương pháp điều tra trực tiếp kết hợp với thu thập thông tin của Trạm cây thuốc Sa Pa và phỏng vấn trực tiếp người dân tại nơi điều tra.
- Tham khảo những tư vấncủa chuyên gia: thu thập thông tin và kinh nghiệm của các chuyên gia trong và ngoài nước trong việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ khí canh để nhân giống và sản xuất các loại cây trồng quý hiếm.
- Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành: Các mẫu Hoàng liên gai sau khi khử trùng được được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Các mẫu được đặt trong phòng nuôi theo chế độ nhiệt độ là 220C, cường độ chiếu sáng 3000-4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày.
19 - Phương pháp phân tích hoạt chất (phương pháp HPTLC, HPLC theo Viện Dược liệu)
- Phương pháp bố trí thí nghiệm (cụ thể theo từng nội dung nghiên cứu)
3.4 Các kỹ thuật sử dụng
+ Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để tạo nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh.
+ Sử dụng các kỹ thuật trong thiết kế, xây dựng quy trình công nghệ chế tạo, lắp đặt các thiết bị thí nghiệm và mô hình sản xuất công nghiệp sinh học.
+ Sử dụng các kỹ thuật tựđộng hoá trong việc xây dựng dây chuyền công nghệ + Sử dụng các phương pháp nghiên cứu sinh lý thực vật truyền thống và tiên tiến như: kỹ thuật thủy canh, kỹ thuật khí canh, sử dụng các thiết bị cung cấp dinh dưỡng tựđộng và hồi lưu nhằm tiết kiệm tối đa dinh dưỡng, pH, độ dẫn điện (EC) của dung dịch
+ Sử dụng các phương pháp nghiên cứu nông học để đánh giá tình trạng sinh trưởng, phát triển và năng suất của đối tượng nghiên cứu.
+ Sử dụng các thiết bị đo đếm các thông số vềđiều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, độẩm) trong và ngoài nhà sản xuất.
+ Sử dụng kỹ thuật phân tích các thành phần dược liệu
3.5 Bố trí thí nghiệm
3.5.1Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu
Thí nghiệm 1: Điều tra thu thập nguồn gen cây Hoàng liên gai tại Lào Cai
- Thu thập thông tin thông qua Trạm Cây thuốc tại Sa Pa
- Tiến hành khảo sát thực tế tại các điểm có sự phân bố hiện diện của cây Hoàng liên gai đểđánh giá hiện trạng trong tự nhiên.
- Khảo sát đánh giá thực tế việc khai thác, tiêu thụ sản phẩm cây Hoàng liên gai tại địa bàn Sa Pa
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu đánh giá giá trị dược lý của mẫu giống Hoàng liên gai thu thập được.
20 Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai trong tự nhiên và đem đi phân tích hàm lượng berberin tại Viện Dược liệu.
Lượng cây mẫu gửi: 50 cây (0,86kg)
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin xử lý kích thích ra rễ cành giâm nhằm tạo vật liệu sớm đưa vào thử nghiệm trồng khí canh
Công thức 1: Không xử lý αNAA
Công thức 2: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 1000ppm Công thức 3: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 2000ppm Công thức 4: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 3000ppm Công thức 5: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 4000ppm
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi Công thức tiến hành trên 50 cành giâm, tiến hành theo dõi điểm 9 cành, đánh giá tỷ lệ ra rễ của cành giâm của các công thức
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Ngày ra rễ sau giâm - Tỷ lệ ra rễ của cành giâm
- Số lượng rễ ra trên mỗi cành giâm
- Chiều dài rễ của các cành giâm sau một khoảng thời gian
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu phương pháp tạo nguồn vật liệu bằng gieo hạt in vitro
Hạt, đoạn thân mang mắt ngủ của cây Hoàng liên gai được thu thập từ vùng núi Sapa được sử dụng làm vật liệu tạo nguồn vật liệu in vitro ban đầu
Thí nghiệm 4. 1:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chếđộ khử trùng khác nhau đến tỷ lệ sống của các vật liệu vào mẫu in vitro.
- Công thức 1: Khử trùng 1 lần với HgCl2 0,1% trong 5 phút
- Công thức 2: Khử trùng lần 1 với HgCl2 0,1% trong 2 phút và lần 2 với dung dịch Johnson trong 5 phút
21 - Công thức 3: Khử trùng lần 1 với dung dịch Johnson trong 5 phút và
lần 2 với Johnson trong 10 phút
Thí nghiệm 4. 2:Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự tạo chồi các mẫu nuôi cấy.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự nảy mầm của hạt gieo
- Công thức 1: sử dụng nước cất vô trùng - Công thức 2: sử dụng môi trường MS lỏng
- Công thức 3: sử dụng môi trường MS có bổ sung agar
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự cảm ứng bật chồi của đoạn thân
- Công thức 1: MS lỏng
- Công thức 2: MS có bổ sung agar và than hoạt tính - Công thức 3: N6
- Công thức 4: WP
Bố trí thí nghiệm: Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 15 mẫu, lặp lại 3 lần
Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ mẫu sống, chết - Tỷ lệ mẫu bật chồi
3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích ra rễα – NAA đến khả năng hình thành rễ mới trong điều kiện khí canh tại Hà Nội.
CT1 (Đ/C) : không xử lý xửα – NAA
CT2 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 1000ppm CT3 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 2000ppm
22 CT4 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 3000ppm
CT5 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 4000ppm
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi thời vụ tiến hành trên 15 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây đểđánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ số ngọn ra rễ: Số ngọn ra rễ/ Tổng số ngọn giâm
- Số ngày ngọn cắt ra rễ: Tính từ ngày giâm ngọn đến khi cây bắt đầu ra rễ mới
- Số rễ trung bình tạo ra sau những khoảng thời gian trồng khác nhau Chiều dài rễ trung bình: Tính từ gốc rễđến đầu mút của rễ.
Thí nghiệm 2:Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của dung dịch dinh dưỡng đặc hiệu (thành phần dinh dưỡng, pH, EC,…) tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội
Thí nghiệm 2.1:Xác định loại dung dịch dinh dưỡng thích hợp cho cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh.
- CT1: Sử dụng dung dịch dinh dưỡng Woodplant
- CT2: Sử dụng dung dịch dinh dưỡng dùng cho khí canh của Viện Sinh học Nông nghiệp nghiên cứu ra.
Thí nghiệm 2.2: Xác định mức EC thích hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh.
- Công thức 1: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1000µs/cm - Công thức 2: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1300µs/cm. - Công thức 3: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1600µs/cm. - Công thức 4: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1900µs/cm.
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi Công thức tiến hành trên 30 cây, tiến hành theo dõi 9 cây đểđánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây cũng như khả năng tạo sinh khối rễ.
23 - Khả năng tái sinh rễ của cây
- Tốc độ ra lá, phát triển chiều cao và ra rễ của cây - Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội.
- Công thức 1: Phun 15 giây, nghỉ 10 phút - Công thức 2: Phun 15 giây, nghỉ 15 phút - Công thức 3: Phun 15 giây, nghỉ 20 phút
Bố trí thí nghiệm
Mỗi thời vụ tiến hành trên 50 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây đểđánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng - Tốc độ ra lá và ra rễ của cây
- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gaitại Hà Nội
- Công thức 1: Không điều khiển nhiệt độ dung dịch - Công thức 2: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 15OC - Công thức 3: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 20OC - Công thức 4: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 25OC
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, các cây được trồng trên hệ thống khí canh do Viện Sinh học nông nghiệp – Đại học Nông nghiệp Hà nội thiết kế.Các cây sẽ được theo dõi và đánh giá tỷ lệ sống, khả năng sinh trưởng phát triển cũng như khả năng tạo sinh khối rễ.
24 - Nhiệt độ dung dịch của các công thức
- Khả năng sống.
- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng - Tốc độ ra lá và ra rễ của cây
- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại Hà Nội.
- Thời vụ 1: Trồng vào mùa thu (tháng 08/2011) - Thời vụ 2: Trồng vào mùa đông (tháng 11/2011) - Thời vụ 3: Trồng vào mùa xuân (tháng 2/2012) - Thời vụ 4: Trồng vào mùa hè (tháng 5/2012)
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi thời vụ tiến hành trên 50 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây đểđánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sống.
- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng - Tốc độ ra lá và ra rễ của cây
Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu biện pháp thu hoạch sinh khối rễ cây Hoàng liên gai để tăng năng suất trong khí canhtại Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu:
Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần thu hoạch đến sản lượngsản lượng rễ cây Hoàng liên gai trồng bằng hệ thống khí canh.
- Công thức 1: Thu 1 lần sau trồng 10 tháng
- Công thức 2: Thu 2 lần sau trồng 8 tháng và 10 tháng
- Công thức 3: Thu 3 lần sau trồng 6 tháng, 8 tháng, 10 tháng
25 - Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, theo dõi và thu hoạch để đánh giá
khối lượng rễ tươi đạt được và khối lượng rễ sau khi sấy khô. - Mỗi lần thu hoạch tiến hành cắt 50% số rễ của 1 bên.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Khối lượng rễ tươi thu được ở các thời điểm khác nhau - Khối lượng rễ khô thu được tương ứng tại các thời điểm đó
3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sapa.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sa Pa
Thí nghiệm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng α – NAA đến khả năng hình thành rễ mới trong điều kiện khí canh tại Sapa.
CT1 (Đ/C) : không xử lý α – NAA CT2 : xử lý ngọn giâm bằng α – NAA nồng độ 1000ppm CT3 : xử lý ngọn giâm bằng α – NAA nồng độ 2000ppm CT4 : xử lý ngọn giâm bằng α – NAA nồng độ 3000ppm CT5 : xử lý ngọn giâm bằng α – NAA nồng độ 4000ppm Bố trí thí nghiệm:
- Mỗi thời vụ tiến hành trên 50 ngọn giâm, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây đểđánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ số ngọn ra rễ: Số ngọn ra rễ/ Tổng số ngọn giâm
- Số ngày ngọn cắt ra rễ: Tính từ ngày giâm ngọn đến khi cây bắt đầu ra rễ mới
- Số rễ trung bình tạo ra sau những khoảng thời gian trồng khác nhau - Chiều dài rễ trung bình: Tính từ gốc rễđến đầu mút của rễ.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên
26
gaitại Sa Pa
- Công thức 1: Không điều khiển nhiệt độ dung dịch - Công thức 2: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 15OC - Công thức 3: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 25OC
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi Công thức tiến hành trên 20 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây để đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây cũng như khả năng tạo sinh khối rễ.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Nhiệt độ dung dịch của các công thức - Khả năng sống.
- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng - Tốc độ ra lá và ra rễ của cây
- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) của vùng Sa Pa tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa.
Tiến hành bố trí trồng cây Hoàng liên gai trên hệ thống khí canh tại Sa Pa, theo dõi sự biến động của điều kiện ngoại cảnh cũng như sự sinh trưởng phát triển của cây qua các mùa khác nhau đểđánh giá sựảnh hưởng của ngoại cảnh.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Sự ra rễ của cây trong các mùa - Sự lá mới của cây trong các mùa
- Sự tăng trưởng chiều cao của cây trong các mùa
Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai trong khí canh so với trồng địa canh tại Sa Pa.
Bố trí thí nghiệm: Tiến hành trồng 50 cây, theo dõi điểm 9 cây.
Các chỉ tiêu theo dõi
27 - Ngày ra lá mới sau trồng trên khí canh (ngày)
- Chiều cao cây (cm) - Chiều dài rễ (cm) - Số lá (lá/cây) - Số rễ (rễ/cây) - Sốđốt (đốt/cây) - Khối lượng rễ (g/cây)
3.5.4.Nội dung 4: Nghiên cứu thu hoạch, đánh giá các hoạt chất làm thuốc của nguồn sinh khối tạo ra
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thu hoạch sản phẩm: (thời gian, sản phẩm, cách thu hoạch 1 lần hoặc nhiều lần)
Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến sản lượng rễ cây Hoàng liên gai trồng bằng hệ thống khí canh.
- Công thức 1: Thu 1 lần sau trồng 6 tháng - Công thức 2: Thu 1 lần sau trồng 9 tháng - Công thức 3: Thu 1 lần sau trồng 12 tháng
Bố trí thí nghiệm:
Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, theo dõi và thu hoạch để đánh giá khối lượng rễ tươi đạt được và khối lượng rễ sau khi sấy khô.
Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần thu hoạch đến sản lượngsản lượng rễ cây Hoàng liên gai trồng bằng hệ thống khí canh.