2.3.1. Trang thiết bị
Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Hệ thống nguyên tử hoá bằng ngọn lửa của hãng Perkin-Elmer. Cân phân tích chính xác đến 0.01mg.
Máy li tâm.
Tủ lạnh để bảo quản mẫu huyết thanh.
2.3.2. Hoá chất và dụng cụ
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:
2.3.2.1. Hóa chất
- Dung dịch Ca chuẩn 1000 mg/l.
- Dung dịch Mg chuẩn 1000 mg/l. - Dung dịch Na 10 g/l:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cân chính xác 2,543 g NaCl pha trong 100 ml nước cất. - Dung dịch K 10 g/l:
Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100 ml nước cất. - Nước cất.
- Dung dịch LaCl310%:
Cân chính xác 3,3489 gam LaCl3 .7H2O pha trong 25ml nước cất.
2.3.2.2. Dụng cụ
Ống nghiệm, pipet, bình định mức 25ml, 50ml, 100ml, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, ống đong, …
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu[10]
Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…
Phân tích phương sai một yếu tố:
Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm. Mục đích của sự phân tích phương sai một yếu tố là đánh giá sự ảnh hưởng của một yếu tố nào đó trên các giá trị quan sát, Yi (i = 1, 2,…, k).
Trong bài toán phân tích phương sai một yếu tố A, k mức thí nghiệm, mỗi mức nghiên cứu làm lặp lại n lần, chuẩn F được dùng để so sánh sự sai khác giữa phương sai các giá trị nghiên cứu do sự thay đổi các mức nghiên cứu với phương sai của sai số nghiên cứu có khác nhau đáng tin cậy hay không. Nếu khác nhau không đáng tin cậy, yếu tố A sẽ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm, ngược lại nếu khác nhau đáng tin cậy chứng tỏ yếu tố A có ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong nội dung nghiên cứu đề ra, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố nào đó tới kết quả phân tích. Nội dung của bài toán phân tích phương sai một yếu tố được biểu diễn tóm tắt trong bảng dưới đây:
Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố.
Yếu tố a1 a2 a3 ….. ai … ak 1 y11 y21 y31 yi1 yk1 2 y12 y22 y32 yi2 yk2 ……. j y1j y2j y3j yij ykj …… n y1n y2n y3n yin ykn Tổng A1= n j j y 1 1 A2= n j j y 1 2 A3= n j j y 1 3 Ai= n j ij y 1 Ak= n j kj y 1
Bảng 2.2: Phân tích phương sai một yếu tố.
Nguồn sai số Bậc tự do Tổng các bình phƣơng Bình phƣơng trung bình Yếu tố A k-1 SSA = SS2-SS3 1 2 k SS SA A Sai số thí nghiệm k(n-1) = kn – k SSe = SStotal – SSA ( 1) 2 n k SS S e e Tổng cộng kn - 1 SStotal = SS1- SS3 Trong đó: k i n j ij y SS 1 1 2 1 k i i A n SS 1 2 2 1 2 1 3 1 ( ) k i i A kn SS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Giả thuyết thống kê: Giả thuyết không H0 :
2 2
e A S S
Giả thuyết khác không Ha : SA2 SE2
Tính giá trị thống kê F theo công thức sau: S2A
Ftính = > 1 S2e
So sánh Ftính với Fbảng (P, f1, f2), trong đó f1= k-1 là bậc tự do của mức nghiên cứu đã làm; f2= n(k-1) là bậc tự do của số nghiên cứu đã tiến hành trong quy hoạch nghiên cứu.
2.5. Phƣơng pháp phổ hấp thụ AAS[5]
Đối tượng và phạm vi áp dụng của phương pháp.
Đối tượng phương pháp phân tích AAS là phân tích lượng nhỏ (lượng vết) các kim loại trong các loại mẫu khác nhau của các chất vô cơ và hữu cơ. Với các trang bị và kỹ thuật hiện nay, bằng phương pháp phân tích này người ta có thể định lượng được hầu hết các kim loại (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppm (microgam/g) bằng kỹ thuật F-AAS, và đến nồng độ ppb (ng/g) bằng kỹ thuật ETA-AAS với sai số không lớn hơn 15%.
Những năm gần đây, phương pháp AAS đã được sử dụng rộng rãi để xác định các kim loại trong các mẫu quặng, đất, đá, nước khoáng, các mẫu của y học, sinh học, các sản phẩm nông nghiệp, rau quả, thực phẩm, nước uống, các nguyên tố vi lượng trong phân bón, trong thức ăn gia súc,…v.v. Ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các nước phát triển, phương pháp AAS đã trở thành một phương pháp tiêu chuẩn để định lượng nhiều kim loại.
Bên cạnh các kim loại, một vài á kim như Si, P, S, Se, Te,... cũng được xác định bằng phương pháp phân tích này. Các á kim khác như C, Cl, O, N, không xác định trực tiếp được bằng phương pháp này. Vì các vạch phân tích của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các á kim này thường nằm ngoài vùng phổ của các máy hấp thụ nguyên tử thông dụng. (190 - 900nm).
+ Ƣu và nhƣợc của phép đo AAS.
- Ƣu điểm:
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử có độ nhạy và độ chọn lọc tương đối cao. Gần 60 nguyên tố hoá học có thể được xác định bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10-4
đến 1.10-5 %. Đặc biệt, nếu sử dụng kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa thì có thể đạt đến độ nhạy n.10-7
%.
Tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian, không cần phải dùng nhiều hoá chất tinh khiết cao khi làm giàu mẫu. Mặt khác tránh được sự nhiễm bẩn mẫu khi xử lý qua các giai đoạn phức tạp.
Các động tác thực hiện nhẹ nhàng. Các kết quả phân tích lại có thể ghi lại trên băng giấy hay giản đồ để lưu giữ lại sau này. Đồng thời với các trang thiết bị hiện nay người ta có thể xác định đồng thời hay liên tiếp nhiều nguyên tố trong một mẫu.
- Nhƣợc điểm:
Điều hạn chế trước hết là muốn thực hiện phép đo này cần phải có một hệ thống máy AAS tương đối đắt tiền. Do đó nhiều cơ sở nhỏ không đủ điều kiện để xây dựng phòng thí nghiệm và mua sắm máy móc. Mặt khác cũng chính do phép đo có độ nhạy cao, cho nên sự nhiễm bẩn dễ ảnh hưởng tới kết quả phân tích hàm lượng vết. Trang thiết bị máy móc là khá tinh vi, phức tạp.
Nhược điểm chính của phương pháp phân tích này là chỉ cho ta biết thành phần nguyên tố của chất ở trong mẫu phân tích, không chỉ ra trạng thái liên kết của nguyên tố ở trong mẫu. Vì thế nó chỉ là phương pháp phân tích thành phần hoá học của nguyên tố mà thôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn C (g/mL A (a) 0 1 2 3 4 5 6
+ Cơ sở lý thuyết của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử.
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử đám hơi nguyên tử của mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ (hấp thụ năng lượng của tia bức xạ). Phần tử hấp thụ năng lượng của tia bức xạ h là các nguyên tử tự do trong đám hơi đó. Do đó muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng đơn sắc có những bước sóng nhất định ứng đúng với các tia phát xạ nhạy của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lượng của chùm tia sáng đó và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
Phương pháp phân tích định lượng bằng phép đo hấp thụ nguyên tử dựa trên phương trình cơ bản: A = a.Cb
Hình 2.1: Đường chuẩn phổ hấp thụ AAS
Trong đó: .
A : Cường độ vạch phổ.
b : hằng số bản chất 0 < b 1 (khi nồng độ phân tích nhỏ thì b =1) a: hằng số a = K.L
L: bề dày môi trường hấp thụ (chiều dày cuvet grafit, ngọn lửa) K = k.k’: hằng số thực nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Cấu tạo của máy AAS.
Phần 1. Nguồn phát tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố phân tích Phần 2. Hệ thống nguyên tử hoá mẫu phân tích. Trong kỹ thuật nguyên
tử hoá bằng ngọn lửa, hệ thống này bao gồm:
Bộ phận dẫn mẫu vào buồng aerôsol hoá và thực hiện quá trình aerôsol hoá mẫu ( tạo thể sol khí).
Bếp để nguyên tử hoá mẫu (burner head) để đốt cháy hỗn hợp khí có chứa mẫu ở thể huyền phù sol khí.
Phần 3. Hệ máy quang phổ hấp thụ, nó là bộ đơn sắc, có nhiệm vụ thu,
phân ly và chọn tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát hiện tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ.
Phần 4. Hệ thống chỉ thị tín hiệu hấp thụ của vạch phổ (tức là cường độ
của vạch phổ hấp thụ hay nồng độ nguyên tố phân tích). Hệ thống này có thể là các trang bị:
+ Đơn giản nhất là một điện kế chỉ năng lượng hấp thu(E) của vạch phổ. + Một máy tự ghi pic của vạch phổ.
+ Hoặc bộ hiện số digital.
+ Hay bộ máy tính và máy in (printer), hoặc máy Intergrator.
Với các máy phổ AAS hiện đại còn có thêm một microcomputer hay microprocessor, và hệ thống phần mềm. Loại trang bị này có nhiệm vụ điều khiển quá trình đo và xử lý các kết quả đo đạc, vẽ đồ thị, tính nồng độ của mẫu phân tích, v.v.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo nguyên tắc máy đo phổ hấp thụ nguyên tử.
1.Nguồn phát tia đơn sắc (đèn catot rỗng) 2.Hệ thống nguyên tử hóa mẫu.
3.Hệ thống phân ly quang học và ghi nhận tín hiệu. 4. Bộ phận khuếch đại và chỉ thị kết quả đo.
5. Máy tính điều khiển (computer)
+ Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu
phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Đó là qúa trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu. Đám hơi này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử của nguyên tố cần phân tích.
Bƣớc 2: Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân
tích qua đám hơi nguyên tử vừa tạo ra được ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó.
Bƣớc 3: Nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm
sáng, phân ly và chọn 1 vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử.
5
1 3
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình phân tích Canxi
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi 3.1.1.1. Lựa chọn kỹ thuật nguyên tử hóa 3.1.1.1. Lựa chọn kỹ thuật nguyên tử hóa
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử gồm có ba kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu: Nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa, nguyên tử hóa mẫu bằng lò graphit và kỹ thuật hóa hơi lạnh, việc sử dụng các kỹ thuật nguyên tử hóa phụ thuộc vào nồng độ và tính chất của nguyên tố phân tích. Trong mẫu huyết thanh hàm lượng canxi , giao động trong khoảng từ 88 đến 112 ppm, do vậy chúng tôi lựa chọn kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa, kỹ thuật này vừa đáp ứng được yêu cầu về độ nhay, khoảng tuyến tính và phù hợp với đối tượng mẫu phân tích là huyết thanh.
Khí tạo ngọn lửa là hỗn hợp không khí nén và axetilen đạt được nhiệt độ tối đa là 2450o
C thỏa mãn 5 yêu cầu phân tích, hạn chế sự ion hóa làm giảm nguyên tử tự do và hạn chế sự phát xạ nguyên tử.
3.1.1.2. Khảo sát chọn bƣớc sóng hấp thụ
Mỗi loại nguyên tử của một nguyên tố hóa học chỉ có thể hấp thụ những bức xạ có bước sóng mà chính nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ. Nhưng thực tế không phải mỗi loại nguyên tử có thể hấp thụ được tất cả các bức xạ mà nó phát ra, quá trình hấp thụ chỉ tốt chủ yếu đối với các vạch nhạy( vạch đặc trưng). Đối với một nguyên tố vạch phổ nào có khả năng hấp thụ càng mạnh thì phép đo vạch đó có độ nhạy càng cao. Như vậy đối với một nguyên tố các vạch phổ khác nhau sẽ có độ nhạy khác nhau. Vì mục đích xác định hàm lượng Canxi trong huyết thanh thường có nồng độ nhỏ nên chúng tôi tiến hành khảo sát để
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tìm ra vạch phổ có độ nhạy cao. Nguyên tố Canxi có 2 bước sóng đặc trưng và nhạy nhất là 239,9 nm và 422,7 nm.
Chọn dung dịch Canxi chuẩn 1000 mg/l. Lấy 0,05 ml dd Ca chuẩn vào bình định mức 50 ml và định mức bằng nước cất được dung dịch Ca 1,0 ppm. Tiến hành đo Canxi ta thu đươc kết quả như sau :
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát bước sóng đặc trưng của Canxi.
Bƣớc sóng 239,9 nm 422,7 nm
Đo lần 1 0,003(A) 0,055(A)
Đo lần 2 0.001(A) 0,055(A)
Đo lần 3 0,004(A) 0,055(A)
Kết luận Nhiễu, không ổn định Tốt, ổn định
Từ kết quả trên, với phép đo Canxi trong máu chúng tôi chọn bước sóng cho kết quả ổn định và tốt nhất là 422,7 nm.
3.1.1.3. Khảo sát khe đo
Theo nguyên tắc hoạt động của hệ thống đơn sắc trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, chùm tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố cần nghiên cứu được phát xạ từ đèn catot rỗng. Sau khi đi qua môi trường hấp thụ sẽ được hướng vào khe đo của máy, được chuẩn trực, phân ly. Sau đó chỉ một vạch phổ cần đo được chọn và hướng vào khe đo để tác dụng vào nhân quang điện để phát hiện xác định cường độ của vạch phổ.
Khe đo có ảnh hưởng tới độ nhạy và vùng tuyến tính của phép đo. Để vạch phổ đo không bị chen lẫn với các vạch phổ khác khe đo phải không được quá rộng. Mặt khác nếu khe đo quá hẹp thì tín hiệu phổ không ổn định, độ lặp lại kém.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chọn dung dịch Canxi chuẩn 1000 mg/l. Lấy 0,05 ml dd Ca chuẩn vào bình định mức 50 ml và định mức bằng nước cất được dung dịch Ca 1,0 ppm.
Tiến hành đo theo các lần điều chỉnh khe đo khác nhau; các điều kiện khác giữ nguyên ta được kết quả như sau:
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khe đo đặc trưng đo Canxi.
Khe đo 0,2 nm 0,7 nm
Đo lần 1 Nhiễu 0,054(A)
Đo lần 2 Nhiễu 0,054(A)
Đo lần 3 Nhiễu 0,054(A)
Kết luận Nhiễu, không ổn định Tốt, ổn định
Do đó trong phép đo Canxi trong máu chúng tôi chọn khe đo cho kết quả ổn định và tốt nhất là 0,7 nm.
3.1.1.4. Khảo sát cƣờng độ dòng đèn catot rỗng