Để phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh, tác giả Vũ Đức Lợi [2] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền LaCl3 và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc. Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như chuẩn độ, sắc ký lỏng.. thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn là mẫu sinh học mà cụ thể là mẫu máu của người. Máu là tổ chức lỏng, lưu thông trong hệ tuần hoàn. Trong 1 kg thể trọng có 75 – 80 ml máu. Trẻ sơ sinh có 100 ml máu /kg cân nặng, sau đó khối lượng máu giảm dần. Từ 2 - 3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định. Một người trưởng thành bình thường máu chiếm 7 - 9% trọng lượng cơ thể. Một người nặng 50kg có khoảng 4 lít máu. Người ta có thể xác định khối lượng máu chính xác bằng nhiều phương pháp khác nhau: Phương pháp tiêm các chất có màu vào máu, chất này ít bị lọc ra khỏi thận, phân huỷ nhanh và không độc hại hoặc dùng các chất đồng vị phóng xạ đánh dấu hồng cầu. Khối lượng máu tăng lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, khi truyền dịch... Khối lượng máu giảm khi cơ thể ra nhiều mồ hôi, nôn mửa, ỉa chảy, chấn thương có chảy máu bên trong hoặc bên ngoài cơ thể ... Nếu khối lượng máu tăng lên trong cơ thể, dịch từ máu sẽ vào khoảng gian bào của da và các mô, sau đó nước được bài xuất dần theo nước tiểu. Nếu khối lượng máu giảm trong cơ thể, dịch từ khoảng gian bào vào máu làm cho khối lượng máu tăng lên. Trong nhiều trường hợp mất máu cấp diễn (mất máu ở các tạng lớn, các xương lớn, mất máu đường động mạch ...) khối lượng máu bị giảm đột ngột, cơ thể không có khả năng tự bù trừ, nếu không cấp cứu kịp thời cơ thể sẽ không sống được.
Máu gồm hai thành phần: Thể hữu hình (huyết cầu) và huyết tương. Các thể hữu hình của máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, chỉ số này được gọi là hematocrit. Hồng cầu là thành phần chiếm chủ yếu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong thể hữu hình. Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu. Huyết tương chứa nước, protein, các chất điện giải, các hợp chất hữu cơ và vô cơ, các hocmon, các vitamin, các chất trung gian hoá học, các sản phẩm chuyển hoá ... Huyết tương chứa toàn bộ các chất cần thiết cho cơ thể và toàn bộ các chất cần được thải ra ngoài. Huyết tương bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết thanh. Máu có rất nhiều chức năng, dưới đây là những chức năng cơ bản của máu:
Chức năng dinh dưỡng: Máu mang trong mình toàn bộ các chất dinh dưỡng để nuôi cơ thể. Các chất dinh dưỡng được đưa từ ngoài vào qua đường tiêu hoá. Ngoài ra bạch cầu còn vào lòng ống tiêu hoá nhận các chất dinh dưỡng theo kiểu "ẩm bào" và "thực bào", rồi lại vào lòng mạch mang thêm một phần các chất dinh dưỡng cho máu.
Chức năng bảo vệ: Máu có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm trùng nhờ cơ chế thực bào, ẩm bào và cơ chế miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào. Máu cũng có khả năng tham gia vào cơ chế tự cầm máu, tránh mất máu cho cơ thể khi bị tổn thương mạch máu có chảy máu.
Chức năng hô hấp: Máu mang oxy từ phổi tới tế bào và mô, đồng thời máu mang cacbonic từ tế bào và mô tới phổi.
Chức năng đào thải: Máu mang các chất sau chuyển hoá, chất độc, chất lạ tới các cơ quan đào thải (thận, bộ máy tiêu hoá, phổi, da) để thải ra ngoài.
Chức năng điều hoà thân nhiệt: Máu mang nhiệt ở phần "lõi" của cơ thể ra ngoài thải vào môi trường hoặc giữ nhiệt cho cơ thể nhờ cơ chế co mạch da.
Chức năng điều hoà các chức phận cơ thể: Bằng sự điều hoà tính hằng định nội môi, máu đã tham gia vào điều hoà toàn bộ các chức phận cơ thể bằng cơ chế thần kinh và thần kinh - thể dịch.
Đặc tính của máu: Máu có tính hằng định. Tính hằng định của máu được đánh giá qua các chỉ số sinh lý, sinh hoá của máu. Các chỉ số này, trong điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kiện sinh lý bình thường là rất ít thay đổi hoặc chỉ thay đổi trong một phạm vi rất hẹp. Vì vậy chúng được coi như là một hằng số. Kiểm tra các chỉ số sinh lý, sinh hoá của máu là một việc làm vô cùng quan trọng và rất cần thiết để đánh giá những rối loạn chức năng của cơ thể.
Mục đích nghiên cứu: Xuất phát từ vai trò và những tác dụng hóa sinh
của nó đối với cơ thể con người nên việc xác định hàm lượng Canxi trong các mẫu sinh học (huyết thanh) là rất cần thiết. Do đó, trong khuôn khổ của khóa luận này chúng tôi nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo, các yếu tố ảnh hưởng để từ đó xây dựng được quy trình phân tích xác định được hàm lượng Canxi trong mẫu huyết thanh. Từ đó tạo tiền đề cho việc chuẩn đoán cũng như điều trị bệnh.
Mẫu huyết thanh của người bình thường, không có các triệu chứng về bệnh còi xương tuổi từ sơ sinh đến 70 tuổi (nhóm đối chứng)
Mẫu huyết thanh của nhóm trẻ mắc bệnh còi xương.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi.
+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi.
+ Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng Canxi trong huyết thanh.
+ Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng Canxi trong huyết thanh bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử.
+ Đánh giá phương pháp.
+ Phân tích, đánh giá hàm lượng Canxi trong huyết thanh nhóm đối chứng và trong huyết thanh trẻ mắc bệnh còi xương.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, lấy khoảng 2ml mẫu máu cho vào ống nghiệm, ly tâm để tách huyết thanh, cho vào các ống bằng polypropylen có đậy nắp kín. Chú ý tuyệt đối tránh vỡ hồng cầu. Bảo quản lạnh ở -200C, mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể bảo quản ổn định trong vòng một tháng.
Các mẫu huyết thanh lấy từ tủ lạnh ra được để rã đông ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó lắc đều.
Lấy 0,25 ml huyết thanh đã để rã đông thêm 0,25 ml dung dịch LaCl3 10% vào bình định mức 25ml sau đó thêm nước cất, lắc đều ta được mẫu đo.
2.3. Trang thiết bị và hoá chất 2.3.1. Trang thiết bị 2.3.1. Trang thiết bị
Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Hệ thống nguyên tử hoá bằng ngọn lửa của hãng Perkin-Elmer. Cân phân tích chính xác đến 0.01mg.
Máy li tâm.
Tủ lạnh để bảo quản mẫu huyết thanh.
2.3.2. Hoá chất và dụng cụ
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:
2.3.2.1. Hóa chất
- Dung dịch Ca chuẩn 1000 mg/l.
- Dung dịch Mg chuẩn 1000 mg/l. - Dung dịch Na 10 g/l:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cân chính xác 2,543 g NaCl pha trong 100 ml nước cất. - Dung dịch K 10 g/l:
Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100 ml nước cất. - Nước cất.
- Dung dịch LaCl310%:
Cân chính xác 3,3489 gam LaCl3 .7H2O pha trong 25ml nước cất.
2.3.2.2. Dụng cụ
Ống nghiệm, pipet, bình định mức 25ml, 50ml, 100ml, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, ống đong, …
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu[10]
Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…
Phân tích phương sai một yếu tố:
Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm. Mục đích của sự phân tích phương sai một yếu tố là đánh giá sự ảnh hưởng của một yếu tố nào đó trên các giá trị quan sát, Yi (i = 1, 2,…, k).
Trong bài toán phân tích phương sai một yếu tố A, k mức thí nghiệm, mỗi mức nghiên cứu làm lặp lại n lần, chuẩn F được dùng để so sánh sự sai khác giữa phương sai các giá trị nghiên cứu do sự thay đổi các mức nghiên cứu với phương sai của sai số nghiên cứu có khác nhau đáng tin cậy hay không. Nếu khác nhau không đáng tin cậy, yếu tố A sẽ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm, ngược lại nếu khác nhau đáng tin cậy chứng tỏ yếu tố A có ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong nội dung nghiên cứu đề ra, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố nào đó tới kết quả phân tích. Nội dung của bài toán phân tích phương sai một yếu tố được biểu diễn tóm tắt trong bảng dưới đây:
Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố.
Yếu tố a1 a2 a3 ….. ai … ak 1 y11 y21 y31 yi1 yk1 2 y12 y22 y32 yi2 yk2 ……. j y1j y2j y3j yij ykj …… n y1n y2n y3n yin ykn Tổng A1= n j j y 1 1 A2= n j j y 1 2 A3= n j j y 1 3 Ai= n j ij y 1 Ak= n j kj y 1
Bảng 2.2: Phân tích phương sai một yếu tố.
Nguồn sai số Bậc tự do Tổng các bình phƣơng Bình phƣơng trung bình Yếu tố A k-1 SSA = SS2-SS3 1 2 k SS SA A Sai số thí nghiệm k(n-1) = kn – k SSe = SStotal – SSA ( 1) 2 n k SS S e e Tổng cộng kn - 1 SStotal = SS1- SS3 Trong đó: k i n j ij y SS 1 1 2 1 k i i A n SS 1 2 2 1 2 1 3 1 ( ) k i i A kn SS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Giả thuyết thống kê: Giả thuyết không H0 :
2 2
e A S S
Giả thuyết khác không Ha : SA2 SE2
Tính giá trị thống kê F theo công thức sau: S2A
Ftính = > 1 S2e
So sánh Ftính với Fbảng (P, f1, f2), trong đó f1= k-1 là bậc tự do của mức nghiên cứu đã làm; f2= n(k-1) là bậc tự do của số nghiên cứu đã tiến hành trong quy hoạch nghiên cứu.
2.5. Phƣơng pháp phổ hấp thụ AAS[5]
Đối tượng và phạm vi áp dụng của phương pháp.
Đối tượng phương pháp phân tích AAS là phân tích lượng nhỏ (lượng vết) các kim loại trong các loại mẫu khác nhau của các chất vô cơ và hữu cơ. Với các trang bị và kỹ thuật hiện nay, bằng phương pháp phân tích này người ta có thể định lượng được hầu hết các kim loại (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppm (microgam/g) bằng kỹ thuật F-AAS, và đến nồng độ ppb (ng/g) bằng kỹ thuật ETA-AAS với sai số không lớn hơn 15%.
Những năm gần đây, phương pháp AAS đã được sử dụng rộng rãi để xác định các kim loại trong các mẫu quặng, đất, đá, nước khoáng, các mẫu của y học, sinh học, các sản phẩm nông nghiệp, rau quả, thực phẩm, nước uống, các nguyên tố vi lượng trong phân bón, trong thức ăn gia súc,…v.v. Ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các nước phát triển, phương pháp AAS đã trở thành một phương pháp tiêu chuẩn để định lượng nhiều kim loại.
Bên cạnh các kim loại, một vài á kim như Si, P, S, Se, Te,... cũng được xác định bằng phương pháp phân tích này. Các á kim khác như C, Cl, O, N, không xác định trực tiếp được bằng phương pháp này. Vì các vạch phân tích của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các á kim này thường nằm ngoài vùng phổ của các máy hấp thụ nguyên tử thông dụng. (190 - 900nm).
+ Ƣu và nhƣợc của phép đo AAS.
- Ƣu điểm:
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử có độ nhạy và độ chọn lọc tương đối cao. Gần 60 nguyên tố hoá học có thể được xác định bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10-4
đến 1.10-5 %. Đặc biệt, nếu sử dụng kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa thì có thể đạt đến độ nhạy n.10-7
%.
Tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian, không cần phải dùng nhiều hoá chất tinh khiết cao khi làm giàu mẫu. Mặt khác tránh được sự nhiễm bẩn mẫu khi xử lý qua các giai đoạn phức tạp.
Các động tác thực hiện nhẹ nhàng. Các kết quả phân tích lại có thể ghi lại trên băng giấy hay giản đồ để lưu giữ lại sau này. Đồng thời với các trang thiết bị hiện nay người ta có thể xác định đồng thời hay liên tiếp nhiều nguyên tố trong một mẫu.
- Nhƣợc điểm:
Điều hạn chế trước hết là muốn thực hiện phép đo này cần phải có một hệ thống máy AAS tương đối đắt tiền. Do đó nhiều cơ sở nhỏ không đủ điều kiện để xây dựng phòng thí nghiệm và mua sắm máy móc. Mặt khác cũng chính do phép đo có độ nhạy cao, cho nên sự nhiễm bẩn dễ ảnh hưởng tới kết quả phân tích hàm lượng vết. Trang thiết bị máy móc là khá tinh vi, phức tạp.
Nhược điểm chính của phương pháp phân tích này là chỉ cho ta biết thành phần nguyên tố của chất ở trong mẫu phân tích, không chỉ ra trạng thái liên kết của nguyên tố ở trong mẫu. Vì thế nó chỉ là phương pháp phân tích thành phần hoá học của nguyên tố mà thôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn C (g/mL A (a) 0 1 2 3 4 5 6
+ Cơ sở lý thuyết của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử.
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử đám hơi nguyên tử của mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ (hấp thụ năng lượng của tia bức xạ). Phần tử hấp thụ năng lượng của tia bức xạ h là các nguyên tử tự do trong đám hơi đó. Do đó muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng đơn sắc có những bước sóng nhất định ứng đúng với các tia phát xạ nhạy của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lượng của chùm tia sáng đó và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.