Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch. Việc tro hoá thường được bổ xung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1], [3], [6].
Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:
- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu - Tro hoá, đốt cháy các chất hữu cơ của mẫu
- Phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu
- Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của mẫu về dạng đơn giản (từ dạng hữu cơ sang vô cơ)
- Quá trình ôxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong mẫu - Giải phóng ra một số khí như CO, CO2, SO2, ....
- Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với chất phụ gia thêm vào, ... tạo thành các chất lúc đầu không có.
Đối với phân tích hàm lượng các kim loại không bay hơi trong các mẫu có hàm lượng hữu cơ cao, tro hoá khô là một phương pháp tương đối đơn giản để phá vỡ các chất hữu cơ và không tốn nhiều thời gian. Nhược điểm chính của kỹ thuật này là khả năng mất một số nguyên tố phân tích do sự bay hơi hay nhiễm bẩn mẫu bởi bụi trong không khí và sự hấp phụ chất lên chén đựng mẫu [3]. Nhiều tác giả đã đã sử dụng kỹ thuật tro hoá khô để xử lý mẫu sinh học nhằm xác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
định hàm lượng đồng, kẽm, sắt trong mẫu tóc, và máu người. Mẫu được cho vào chén thạch anh và đun nhẹ ở nhiệt độ thấp. Sau đó đặt vào lò nung ở 500o
C trong 3 giờ. Tro nung được làm ẩm với 0,5 ml nước, sau đó thêm lần lượt 0,5 ml HNO3 và 0,5 ml HClO4 đặc, tiếp tục đun ở 200oC. Tro ẩm được xử lý tiếp với 0,5 ml HNO3 đặc và nước sau đó đun nhẹ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Độ thu hồi khi phân tích các nguyên tố trong mẫu tóc nằm trong khoảng 94 – 108%.
1.4.2. Kỹ thuật vô cơ hoá ƣớt ở áp suất khí quyển
Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh vμ có tính ôxy hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong cốc thuỷ tinh (hệ hở). Lượng axit thường gấp 10-15 lần lượng mẫu. Thời gian xử lý mẫu thường từ vài giờ đến vài chục giờ [3]. Axit nitric thường được sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu như HCl và H2SO4. Hydro peroxit H2O2 cũng có thể được thêm vào để tăng khả năng ôxy hoá [1],[6]. Các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lượng nhiệt khi đun sôi mẫu. Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết. Tuy tương đối đơn giản và không đắt tiền, xử lý mẫu trong cốc hở hay bình Ken dan được sử dụng nhiều trong việc xử lý các mẫu sinh học, mặc dù thời gian phân hủy mẫu bị kéo dài.
1.4.3. Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao
Phân huỷ mẫu trong hệ kín lò vi sóng có nhiều ưu điểm hơn hệ hở. Các ống đựng mẫu được làm bằng vật liệu polyme chịu áp suất cao, bền với các tác động hoá học, ít chứa các kim loại gây nhiễm bẩn hơn các cốc thuỷ tinh hay chén sứ. Vì các ống đựng mẫu được đậy kín nên loại trừ được sự nhiễm bẩn từ không khí, giảm sự bay hơi nên tốn ít axit. Các ống kín cũng loại trừ được sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mất các kim loại dễ bay hơi có thể xảy ra đối với các hệ hở, đặc biệt trong tro hoá khô. Bộ phận điều khiển điện tử ở các lò vi sóng hiện đại giúp việc xử lý mẫu có độ lặp lại cao. Hơn nữa áp suất cao cho phép phân huỷ hoàn toàn mẫu tóc một cách nhanh chóng [3], [30], [36].
Trong lò vi sóng, ngoài hai tác nhân phân huỷ mẫu là tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axít đặc và của năng lượng nhiệt, còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài do các phân tử nước hấp thụ (>90%) năng lượng vi sóng, chúng có chuyển động nhiệt rất lớn làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Hơn nữa, việc vô cơ hoá được thực hiện trong hệ kín, áp suất cao nên nhiệt độ sôi cao hơn thúc đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất. Vì thế việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 – 70 phút) mà rất triệt để [36]. Tuy nhiên rất ít công trình sử dụng kỹ thuật này để phân tích đồng trong huyết thanh và nước tiểu.
1.4.4. Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền
Để phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh, tác giả Vũ Đức Lợi [2] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền LaCl3 và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc. Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như chuẩn độ, sắc ký lỏng.. thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn là mẫu sinh học mà cụ thể là mẫu máu của người. Máu là tổ chức lỏng, lưu thông trong hệ tuần hoàn. Trong 1 kg thể trọng có 75 – 80 ml máu. Trẻ sơ sinh có 100 ml máu /kg cân nặng, sau đó khối lượng máu giảm dần. Từ 2 - 3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định. Một người trưởng thành bình thường máu chiếm 7 - 9% trọng lượng cơ thể. Một người nặng 50kg có khoảng 4 lít máu. Người ta có thể xác định khối lượng máu chính xác bằng nhiều phương pháp khác nhau: Phương pháp tiêm các chất có màu vào máu, chất này ít bị lọc ra khỏi thận, phân huỷ nhanh và không độc hại hoặc dùng các chất đồng vị phóng xạ đánh dấu hồng cầu. Khối lượng máu tăng lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, khi truyền dịch... Khối lượng máu giảm khi cơ thể ra nhiều mồ hôi, nôn mửa, ỉa chảy, chấn thương có chảy máu bên trong hoặc bên ngoài cơ thể ... Nếu khối lượng máu tăng lên trong cơ thể, dịch từ máu sẽ vào khoảng gian bào của da và các mô, sau đó nước được bài xuất dần theo nước tiểu. Nếu khối lượng máu giảm trong cơ thể, dịch từ khoảng gian bào vào máu làm cho khối lượng máu tăng lên. Trong nhiều trường hợp mất máu cấp diễn (mất máu ở các tạng lớn, các xương lớn, mất máu đường động mạch ...) khối lượng máu bị giảm đột ngột, cơ thể không có khả năng tự bù trừ, nếu không cấp cứu kịp thời cơ thể sẽ không sống được.
Máu gồm hai thành phần: Thể hữu hình (huyết cầu) và huyết tương. Các thể hữu hình của máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, chỉ số này được gọi là hematocrit. Hồng cầu là thành phần chiếm chủ yếu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong thể hữu hình. Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu. Huyết tương chứa nước, protein, các chất điện giải, các hợp chất hữu cơ và vô cơ, các hocmon, các vitamin, các chất trung gian hoá học, các sản phẩm chuyển hoá ... Huyết tương chứa toàn bộ các chất cần thiết cho cơ thể và toàn bộ các chất cần được thải ra ngoài. Huyết tương bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết thanh. Máu có rất nhiều chức năng, dưới đây là những chức năng cơ bản của máu:
Chức năng dinh dưỡng: Máu mang trong mình toàn bộ các chất dinh dưỡng để nuôi cơ thể. Các chất dinh dưỡng được đưa từ ngoài vào qua đường tiêu hoá. Ngoài ra bạch cầu còn vào lòng ống tiêu hoá nhận các chất dinh dưỡng theo kiểu "ẩm bào" và "thực bào", rồi lại vào lòng mạch mang thêm một phần các chất dinh dưỡng cho máu.
Chức năng bảo vệ: Máu có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm trùng nhờ cơ chế thực bào, ẩm bào và cơ chế miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào. Máu cũng có khả năng tham gia vào cơ chế tự cầm máu, tránh mất máu cho cơ thể khi bị tổn thương mạch máu có chảy máu.
Chức năng hô hấp: Máu mang oxy từ phổi tới tế bào và mô, đồng thời máu mang cacbonic từ tế bào và mô tới phổi.
Chức năng đào thải: Máu mang các chất sau chuyển hoá, chất độc, chất lạ tới các cơ quan đào thải (thận, bộ máy tiêu hoá, phổi, da) để thải ra ngoài.
Chức năng điều hoà thân nhiệt: Máu mang nhiệt ở phần "lõi" của cơ thể ra ngoài thải vào môi trường hoặc giữ nhiệt cho cơ thể nhờ cơ chế co mạch da.
Chức năng điều hoà các chức phận cơ thể: Bằng sự điều hoà tính hằng định nội môi, máu đã tham gia vào điều hoà toàn bộ các chức phận cơ thể bằng cơ chế thần kinh và thần kinh - thể dịch.
Đặc tính của máu: Máu có tính hằng định. Tính hằng định của máu được đánh giá qua các chỉ số sinh lý, sinh hoá của máu. Các chỉ số này, trong điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kiện sinh lý bình thường là rất ít thay đổi hoặc chỉ thay đổi trong một phạm vi rất hẹp. Vì vậy chúng được coi như là một hằng số. Kiểm tra các chỉ số sinh lý, sinh hoá của máu là một việc làm vô cùng quan trọng và rất cần thiết để đánh giá những rối loạn chức năng của cơ thể.
Mục đích nghiên cứu: Xuất phát từ vai trò và những tác dụng hóa sinh
của nó đối với cơ thể con người nên việc xác định hàm lượng Canxi trong các mẫu sinh học (huyết thanh) là rất cần thiết. Do đó, trong khuôn khổ của khóa luận này chúng tôi nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo, các yếu tố ảnh hưởng để từ đó xây dựng được quy trình phân tích xác định được hàm lượng Canxi trong mẫu huyết thanh. Từ đó tạo tiền đề cho việc chuẩn đoán cũng như điều trị bệnh.
Mẫu huyết thanh của người bình thường, không có các triệu chứng về bệnh còi xương tuổi từ sơ sinh đến 70 tuổi (nhóm đối chứng)
Mẫu huyết thanh của nhóm trẻ mắc bệnh còi xương.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi.
+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi.
+ Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng Canxi trong huyết thanh.
+ Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng Canxi trong huyết thanh bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử.
+ Đánh giá phương pháp.
+ Phân tích, đánh giá hàm lượng Canxi trong huyết thanh nhóm đối chứng và trong huyết thanh trẻ mắc bệnh còi xương.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, lấy khoảng 2ml mẫu máu cho vào ống nghiệm, ly tâm để tách huyết thanh, cho vào các ống bằng polypropylen có đậy nắp kín. Chú ý tuyệt đối tránh vỡ hồng cầu. Bảo quản lạnh ở -200C, mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể bảo quản ổn định trong vòng một tháng.
Các mẫu huyết thanh lấy từ tủ lạnh ra được để rã đông ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó lắc đều.
Lấy 0,25 ml huyết thanh đã để rã đông thêm 0,25 ml dung dịch LaCl3 10% vào bình định mức 25ml sau đó thêm nước cất, lắc đều ta được mẫu đo.
2.3. Trang thiết bị và hoá chất 2.3.1. Trang thiết bị 2.3.1. Trang thiết bị
Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Hệ thống nguyên tử hoá bằng ngọn lửa của hãng Perkin-Elmer. Cân phân tích chính xác đến 0.01mg.
Máy li tâm.
Tủ lạnh để bảo quản mẫu huyết thanh.
2.3.2. Hoá chất và dụng cụ
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:
2.3.2.1. Hóa chất
- Dung dịch Ca chuẩn 1000 mg/l.
- Dung dịch Mg chuẩn 1000 mg/l. - Dung dịch Na 10 g/l:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cân chính xác 2,543 g NaCl pha trong 100 ml nước cất. - Dung dịch K 10 g/l:
Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100 ml nước cất. - Nước cất.
- Dung dịch LaCl310%:
Cân chính xác 3,3489 gam LaCl3 .7H2O pha trong 25ml nước cất.
2.3.2.2. Dụng cụ
Ống nghiệm, pipet, bình định mức 25ml, 50ml, 100ml, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, ống đong, …
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu[10]
Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…
Phân tích phương sai một yếu tố:
Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm. Mục đích của sự phân tích phương sai một yếu tố là đánh giá sự ảnh hưởng của một yếu tố nào đó trên các giá trị quan sát, Yi (i = 1, 2,…, k).
Trong bài toán phân tích phương sai một yếu tố A, k mức thí nghiệm, mỗi mức nghiên cứu làm lặp lại n lần, chuẩn F được dùng để so sánh sự sai khác giữa phương sai các giá trị nghiên cứu do sự thay đổi các mức nghiên cứu với phương sai của sai số nghiên cứu có khác nhau đáng tin cậy hay không. Nếu khác nhau không đáng tin cậy, yếu tố A sẽ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm, ngược lại nếu khác nhau đáng tin cậy chứng tỏ yếu tố A có ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong nội dung nghiên cứu đề ra, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố nào đó tới kết quả phân tích. Nội dung của bài toán phân tích phương sai một yếu tố được biểu diễn tóm tắt trong bảng dưới đây:
Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố.
Yếu tố a1 a2 a3 ….. ai … ak 1 y11 y21 y31 yi1 yk1