Canxi giúp phân chia tế bào, điều hòa co và dãn cơ, giữ cho tim đập và não bộ làm việc. Ngoài ra, Canxi tham gia kiểm soát huyết áp, và là yếu tố cần thiết trong sự đông máu cho cơ thể. Protein và dưỡng chất từ bên ngoài vào bên trong tế bào để được sử dụng cũng cần sự tham gia của Canxi. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, Canxi có thể bảo vệ quả tim khỏi bị thiếu máu nuôi, và thậm chí có thể ngăn ngừa một số loại ung thư. Chính vì vai trò thiết yếu của Canxi trong hoạt động sống của cơ thể như vậy, cơ thể bằng mọi cách phải duy trì lượng Canxi trong máu ổn định để từ đó cung cấp cho những nơi có nhu cầu. Do đó, nếu bạn không cung cấp đủ Canxi thỏa mãn nhu cầu cơ thể từ bên ngoài qua đường ăn uống, cơ thể bạn sẽ rút Canxi từ một kho Canxi, đó là xương.
1.2.6. Ảnh hƣởng do thừa và thiếu Canxi[7]
Ở mỗi giai đoạn tuổi tác thì triệu chứng thiếu Canxi biểu hiện khác nhau. Phụ nữ sau khi mang bầu, thai nhi trong tử cung rất cần canxi cho sự phát triển, sinh trưởng, lượng Canxi cần cho mỗi ngày là 1500mg. Nếu lượng Canxi bổ sung không đủ, thai nhi biểu hiện các triệu chứng mềm xương, bà mẹ đang trong thời kỳ cho con bú mỗi ngày cần hấp thụ đủ 2000mg Canxi, để cung cấp cho sự phát triển bình thường của thai nhi. Trẻ em thiếu Canxi sẽ biểu hiện sự phát triển của xương bị trở ngại, cơ thể nhỏ, thấp, chân đi vòng kiềng hoặc khoèo tréo chân. Người lớn thiếu Canxi thường biểu hiện bằng triệu chứng cơ bắp bụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chân dưới bị chuột rút, chân tay bị co quắp. Người già thiếu Canxi thường biểu hiện bằng triệu chứng loãng xương, dễ phát sinh chất xương tăng sinh.
Có mấy nguyên nhân sau dẫn tới cơ thể bị thiếu Canxi:
Một là lượng Canxi chứa trong đồ ăn thức uống 3 bữa trong ngày quá ít, cung cấp không đủ.
Hai là hàm lượng Canxi trong thực phẩm tuy khá cao, nhưng do thành phần thực vật trong thực phẩm cao, chất béo cao, protein lại hơi thấp, ảnh hưởng tới quá trình hấp thụ Canxi.
Ba là với người mắc các chứng bệnh tiêu chảy mãn tính, rò mật, tiêu hóa kém, hấp thụ Canxi sẽ kém.
Khi cơ thể hấp thu quá nhiều Canxi, thận sẽ phải làm việc nhiều để thải lượng dư thừa, lâu ngày sẽ gây sỏi thận, khớp vai, canxi hóa động mạch, nhất là đối với phụ nữ mang thai. Thai phụ thừa Canxi và Vitamin D làm cho thai nhi có khả năng bị thừa Canxi trong máu, sau khi ra đời, thóp kín quá sớm, xương hàm rộng và nhô ra, động mạch chủ bị thu hẹp, vừa không có lợi cho sức khoẻ, vừa ảnh hưởng đến vẻ đẹp sắc mặt của đời sau. Lượng Canxi thừa lắng đọng ở bánh rau , làm giảm sự trao đổi chất với thai nhi, khiến thai kém phát triển. Người mẹ uống quá nhiều Canxi còn có thể bị sỏi đường tiết niệu, đặc biệt là sỏi thận.
1.3. Các phƣơng pháp phân tích Canxi 1.3.1. Phƣơng pháp xác định Ca2+ tự do
1.3.1.1. Phƣơng pháp vi điện cực chọn lọc ion Ca2+
Các điện cực chọn lọc ion với lớp màng chọn lọc ion tại đầu điện cực được chế tạo từ một micropipet (đường kính ngoài 0,1 – 1 µm). Màng chọn lọc Ca2+
được chế tạo từ gel polyvinyl clorua có chứa tác nhân tạo phức chọn lọc với Ca2+ tan trong gel polyme. Một tác nhân tạo phức thường được sử dụng là “ETH 1001” và sử dụng thêm một điện cực so sánh tương tự. Để tiến hành các phép đo bên trong điện cực, điện cực so sánh phải được chế tạo từ một micropipet bên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong chứa gel chất điện giải. Thông thường các điện cực chọn lọc ion và điện cực so sánh được kết nối thông qua một vi điện cực hai khoang. Toàn bộ hệ thống có đưa vào trong tế bào bề ngang là 30 – 50 µm sử dụng một máy vi thao tác. Vi điện cực Ca2+
sẽ được sử dụng để xác định các nồng độ Ca2+ tới khoảng 10-8 M. Tuy nhiên, một nhược điểm của kỹ thuật này là thời gian phản hồi chậm, thường trong vài giây hoặc vài phút, khiến cho quá trình xác định nhanh những chuyển biến nồng độ rất khó theo dõi.
1.3.1.2. Phƣơng pháp phát quang sinh học
Một vài cơ quan sinh vật sống có thể phát ra ánh sáng. Hệ thống phát sáng như trong sứa (Aequorea) là một protein gọi là aequorin (Mr ≈ 20 kDa). Ánh sáng phát ra khi trạng thái có năng lượng cao có chứa nhóm giả (coelenterazine) trở về trạng thái cơ bản trong một phản ứng hóa học được kích thích bởi ion Ca2+. Nếu nồng độ Ca2+
nhỏ hơn ~ 0,3 µM thì quá trình phát xạ yếu nhưng trong khoảng nồng độ 0,5 – 10 µM thì quá trình phát xạ là một hàm phụ thuộc vào nồng độ ([Ca2+
]2,5). Phản hồi với quá trình chuyển biến nồng độ Ca2+
rất nhanh ( tại nhiệt độ phòng) và ánh sáng phát xạ có thể đo được chính xác cho dù ở mức độ yếu bằng thiết bị khuếch đại hình ảnh hoặc bộ đếm photon. Để xác định nồng độ Ca2+
trong tế bào, aequorin được bơm vào.
1.3.1.3. Phƣơng pháp tác nhân tạo phức với quá trình hấp thụ hoặc huỳnh quang phụ thuộc vào Ca2+
Năm 1980 R. Y. Tsien đã phát minh quá trình tổng hợp và các tính chất phổ của một vài phẩm nhuộm tetracarboxylat mới có ái lực mạnh và độ chọn lọc cao với Ca2+. Tất cả các thuốc thử này đều có vùng hấp thụ UV cao và phụ thuộc vào việc Ca2+
có ở dạng liên kết hay không, một vài loại khác có huỳnh quang phụ thuộc vào nồng độ Ca2+
. Các phức này có thể được tế bào hấp thụ thành dạng tetraeste vào trong tế bào, sau đó nhanh chóng bị thủy phân do tác dụng của enzim để trả lại các anion có liên kết với Ca2+
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tetracarboxylat có độ chọn lọc tốt với Ca2+
như “BAPTA”, “Quin-2”, “Fura-2”. Các phức này rất thích hợp cho việc xác định các nồng độ Ca2+ trong khoảng 1 µM tới 10 nM trong sự có mặt của 1 mM Mg2+ và 100 mM Na+ và K+.
Ngược phổ phát xạ của Fura -2 có các đỉnh peak trong vùng 505 – 510 nm, ít khi dịch chuyển khi Ca2+
ở dạng liên kết, phổ hấp thụ dịch chuyển sang vùng bước sóng ngắn. Khi nghiên cứu xác định nồng độ Ca2+ tự do cần có so sánh tại bước sóng kích thích 350 nm và 385 nm, sau đó đo tỉ lệ cường độ huỳnh quang tại ~ 510 nm.
1.3.2. Phƣơng pháp xác định tổng Canxi
Hàm lượng tổng Ca trong mẫu sinh học có thể xác định được bằng nhiều phương pháp khác nhau như Phương pháp phổ electron và phổ mất năng lượng electron, Phương pháp phát xạ tia X bởi proton, phương pháp chuẩn độ, phương pháp sắc ký ion.. . Tuy nhiên, phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử là lựa chọn tốt nhất.
1.3.2.1. Phƣơng pháp phổ electron và phổ mất năng lƣợng electron
Khi một chùm electron trong một kính hiển vi electron chiếu tới bề mặt mỏng mẫu, một số nguyên tử trong mẫu sẽ bị kích thích hoặc ion hóa, và khi trở lại trạng thái ban đầu sẽ phát xạ các chùm tia X. Phát xạ tia X tại các bước sóng khác nhau có thể đo được bằng đầu dò nhạy năng lượng photon. Đây chính là cơ sở của phương pháp phân tích hiển vi tia X kích thích electron (EPMA). Các electron đi xuyên qua mẫu, cho các hình ảnh truyền qua trên kính hiển vi electron, mất năng lượng phụ thuộc vào bản chất (tới một mức độ nào đó, trạng thái hóa học) và sự phân bố của các nguyên tố khác nhau. Kết quả của các hiện tượng này là cơ sở của phương pháp phổ mất năng lượng electron (EELS).
Kỹ thuật EPMA được áp dụng để xác định Ca trong các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu mô mà không cần phân hủy mẫu. Thông thường mẫu được làm lạnh nhanh và cắt bản mỏng tại nhiệt độ thấp (-130 °C) để bảo toàn vị trí in vivo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
của các ion và phân tử khuếch tán. Độ phân giải là 10 nm hoặc tốt hơn với các vùng mẫu khô lạnh bề dày ≥ 100 nm. Giới hạn phát hiện là xấp xỉ 0,3 mmol Ca/kg mẫu khô (10 ppm). Nồng độ Ca của mitochondria và endoplasmic reticulum trong tế bào gan của chuột được xác định bằng EPMA.
EELS có ưu điểm là độ phân giải không gian cao hơn EPMA, 1 tới 2,5 nm. Tuy nhiên EELS ít được áp dụng hơn so với EPMA do hai nhược điểm chính là ảnh hưởng nền lớn và nhạy với bề dày của mẫu.
1.3.2.2. Phƣơng pháp phát xạ tia X bởi proton(PIXE)
Mẫu phân tích được chiếu chùm proton có năng lượng cao (1 tới 4 MeV) sẽ phát xạ các tia X đặc trưng giống như trong EPMA. Ưu điểm của phương pháp này là các proton có xu hướng tương tác với nguyên tử do vậy kích thích nguyên tử phát xạ tia X. Do đó độ nhạy xác định từng nguyên tố trong phương pháp PIXE cao hơn so với EPMA và EELS.
Phương pháp PIXE cho phép xác định đồng thời nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu. Tuy nhiên các ứng dụng trong phân tích sinh học còn khá hạn chế.
1.3.2.3. Phƣơng pháp dùng hiển vi điện tử ion
Kính hiển vi điện tử là một kỹ thuật có khả năng xác định tất cả các nguyên tố ở mức độ ppm. Cơ sở của phương pháp này là làm đông cứng mẫu, phân cắt lạnh, làm khô lạnh và đặt trên một nền dẫn điện trong khoang chân không, đặt dưới tác động của chùm ion (ví dụ D2
+
hoặc Ar+). Các ion này sẽ tách bỏ 2 hoặc 3 lớp nguyên tử bề mặt mẫu bằng kỹ thuật tương tác bắn phá. Một phần các nguyên tử được giải phóng có thể tồn tại ở dạng ion. Các dòng ion thứ cấp này sẽ được gia tốc trong thiết bị phổ khối, sau đó chúng được phân tách dựa theo tỉ lệ khối lượng/điện tích. Thiết bị quang ion được thiết kế để bảo toàn độ phân giải không gian của các ion thứ cấp phát xạ và hình ảnh của nguyên tố trong mẫu phân tích có thể thu được có độ phẩn giải lên tới ~ 0,5 µm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.3.1.4.Phƣơng pháp sắc kí lỏng
Người ta đã xác định hàm lượng Canxi trong huyết thanh bằng phương pháp sắc kí lỏng. Dưới các điều kiện cột và thành phần pha động và nhiệt độ thích hợp, các ion sẽ chuyển động dọc theo cột sắc kí và thiết lập trạng thái cân bằng. Tại các giá trị pH khác nhau, các ion này sẽ tách ra khỏi nhau. Nồng độ của Canxi trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector đo quang với chất chỉ thị Erio đen T. Bằng phương pháp này người ta đã xác định được nồng độ các ion ở bước sóng 520 nm tại các giá trị pH là 10,1 và 10,5. Kết quả thu được với độ lệch chuẩn là ±2% và có thể phân tích tới 120 mẫu/giờ, rất thích hợp cho phân tích mẫu hàng loạt. Các nhà khoa học Nhật Bản[34] đã dùng phương pháp trao đổi ion và sắc kí ion để phân tích hàm lượng Canxi trong protein ở dạng tự do và dạng liên kết. Với chất chỉ thị EDTA ở pH 6,5 và dùng detector dẫn điện. Các phương pháp này còn được dùng để xác định nồng độ Canxi trong máu, sữa và trứng Người ta thấy rằng phương pháp này đều cho kết quả tốt, trong đó bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion cho độ lệch chuẩn với Na là 0,9%; với K là 1,0%; với Ca là 0,05% và với Mg là 0,1%.
1.3.2.5. Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử
Phương pháp hấp thụ nguyên tử ngọn lửa cũng được sử dụng rất rộng rãi để xác định nồng độ Canxi trong huyết thanh[35],[37]. Bằng sự kích thích của ngọn lửa, các nguyên tố sẽ hấp thu năng lượng ứng với các bước sóng thích hợp mà nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ. Phương pháp này có thể phân tích được rất nhiều nguyên tố ở dạng tự do và dạng liên kết. Theo [28], phương pháp sắc kí trao đổi ion được dùng để xác định hàm lượng tổng của các nguyên tố K, Ca, Mg trong huyết thanh và so sánh hiệu quả với phương pháp phát xạ nguyên tử và phương pháp hấp thụ nguyên tử. Người ta thấy rằng phương pháp này cho kết quả tốt, độ lệch chuẩn với Canxi là 1,3% .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Như vậy để phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh có thể lựa chọn rất nhiều phương pháp khác nhau. Với mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Các phương pháp trao đổi ion, sắc kí, phân tích dòng chảy….có thể cho độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn và xác định được hàng loạt mẫu nhưng chúng thường chỉ xác định được nồng độ các nguyên tố ở dạng tự do vì thế độ chính xác không lớn hơn nữa giá thành còn cao. Phương pháp hấp thụ nguyên tử có thể áp dụng cho nhiều nguyên tố khác nhau, xác định được tổng hàm lượng các nguyên tố ở cả dạng tự do và dạng liên kết, có thể phân tích hàng loạt mẫu trong thời gian ngắn và giá thành hợp lí. Nồng độ của các nguyên tố cần phân tích trong huyết thanh là rất nhỏ nên cần chọn phương pháp phân tích có giới hạn định lượng càng nhỏ càng tốt, phương pháp hấp thụ nguyên tử thoả mãn được điều kiện này và cũng cho độ chính xác cao.
1.4. Các phƣơng pháp xử lý mẫu huyết thanh
Để xác định hàm lượng canxi trong các mẫu sinh học, nhiều kỹ thuật phân tích cần phải vô cơ hoá mẫu trước khi phân tích. Một số phương pháp ôxy hoá đã được nghiên cứu, phần lớn sử dụng các axit có tính ôxy hoá hoặc persulfat. Tuy nhiên việc đánh giá hiệu quả của quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện. Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit. Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau[3], [1], [36].
Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: tro hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1], [27]. Quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện. Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hay hydro peroxit. Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau.
1.4.1. Kỹ thuật vô cơ hoá khô
Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch. Việc tro hoá thường được bổ xung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1], [3], [6].
Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:
- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu