Hồ Văn Nam (1963) [17] và Trịnh Văn Thịnh (1982) [23] cho biết: Trâu bị bệnh cấp tính có triệu chứng sốt cao, bỏ ăn, điên loạn, chết nhanh. Trâu nhiễm bệnh thể mãn tính thường sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng, liệt chân sau, chết do kiệt sức. Đối với bệnh tiên mao trùng bò, những biểu hiện lâm sàng gần giống như ở trâu, ít thấy các trường hợp cấp tính, con vật có triệu chứng sốt gián đoạn, chậm chạp, hạch lâm ba trước đùi sưng, một số con thủy thũng ở vùng hàm, vùng cổ nhưng không đau, gần chết thì bại liệt.
Lê Ngọc Mỹ (1994) [16] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm
Phan Lục và Nguyễn Văn Thọ (1995) [14] cho biết: tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của bò ở một số địa phương miền Bắc là 5,9%.
Theo Hà Viết Lượng (1998) [15], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%.
Nguyễn Đăng Khải (1995) [6] đã tổng hợp báo cáo của các chi cục thú y các tỉnh miền bắc và cho biết số trâu, bò bị thiệt hại do bệnh tiên mao trùng như sau: Từ năm 1960 - 1965 số gia súc mắc bệnh là 1776, chết 520 con; từ năm 1979 - 1983 số gia súc ốm là 4629, chết 3243 con; từ năm 1984 - 1988 số gia súc ốm là 4028, chết 3710 con; bình quân số trâu bò hàng năm trong thời gian này ở miền Bắc là 1871362 trâu và 894453 bò.
Vương Thị Lan Phương (2004) [20] đã tiến hành nghiên cứu về kháng nguyên bề mặt T. evansi phân lập từ miền Bắc Việt Nam để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp.
Nguyễn Quốc Doanh (1999) [3] đã nghiên cứu về một số đặc điểm sinh học của T. evansi, bệnh học do chúng gây ra và quy trình bảo quản và sử dụng giống T. evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Lê Đức Quyết (1995) [21] cho biết: trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6% - 10,3%.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Trâu của một số xã thuộc huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang. - Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế tạo theo nguyên lý CATT.
3.1.2. Động vật thí nghiệm và vật liệu nghiên cứu* Động vật: * Động vật:
- Trâu ở các địa phương của huyện Yên Sơn. - Chuột bạch: 18 – 20 g/con, khỏe mạnh.
* Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
* Hoá chất nghiên cứu:
- Thuốc nhuộm giemsa. - Nước cất.
- Dung dịch EDTA 1% - Dung dịch formol 10% - Cồn Methanol
- Cồn sát trùng 700 - Dầu bạch dương
* Thuốc để nghiên cứu phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu
- Thuốc trị ký sinh trùng:
+ Berenil: lọ dung dịch 20 ml chứa Diaminazeno aceturato 70 mg, Fenazona (Antipirina) 375 mg . Nhà sản xuất: Intervet Tây Ban Nha.
+ Phar - Trypazen: lọ thuốc bột pha tiêm 1,18 gam chứa 525 mg Diminazen diaceturat. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Pharmavet.
+ Trypanosoma: lọ thuốc bột pha tiêm chứa 125 mg Chlorhydrat chlorur isometamidium. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
+ Trypamidium samorin: gói thuốc bột pha tiêm 125 mg chứa 125 mg Isometamidium Chloride Hypochloride. Nhà sản xuất: MERIAL Pháp.
- Thuốc trợ tim: Cafein Natri Benzoat 20%. Nhà sản xuất: Công ty thuốc thú y Hanvet.
- Thuốc trợ sức, trợ lực: Nước sinh lý mặn, Vitamin C 5%, Vitamin B1 2,5 %.
* Dụng cụ dùng trong nghiên cứu:
- Kính hiển vi quang học. - Lam kính.
- Lamen.
- Kim chích máu. - Tube tráng Heparin.
- Xilanh 1 ml, 3 ml, 5 ml và kim tiêm các loại. - Chuồng nuôi động vật thí nghiệm.
- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thu thập mẫu: các nông hộ, các trại chăn nuôi gia đình tại một số xã thuộc huyệnYên Sơn – tỉnh Tuyên Quang.
- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm - Khoa Chăn nuôi thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 09 tháng 12 năm 2013 đến ngày 31 tháng 5 năm 2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Ứng dụng Kit CATT xác định tình hình nhiễm bệnh tiên mao trùng ởtrâu tại một số xã thuộc huyệnYên Sơn – Tỉnh Tuyên Quang trâu tại một số xã thuộc huyệnYên Sơn – Tỉnh Tuyên Quang
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Yên Sơn – tỉnh Tuyên Quang, so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit chẩn đoán với Kit nhập ngoại và phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
- Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt.
3.3.2. Nghiên cứu phác đồ điều trị bệnh T. evansi cho trâu và đề xuất biện pháp phòng chống
3.3.2.1. Xây dựng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng
- Thử nghiệm tính mẫn cảm của tiên mao trùng với một số thuốc trị TMT.
- Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp. - Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng. - Ứng dụng phác đồ có hiệu quả cao trong điều trị bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu ở huyện Yên Sơn - tỉnh Tuyên Quang.
3.3.2.2. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh T. evansi cho trâu ở huyện Yên Sơn – tỉnh Tuyên Quang
Đề xuất và áp dụng biện pháp phòng chống bệnh TMT trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu
3.4.1.1. Phương pháp lấy máu trâu
- Thu thập mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, phân tầng trên trâu tại huyện Sơn Dương – tỉnh Tuyên Quang.
- Dung lượng mẫu cho đề tài này được tính toán theo công thức của tổ chức WHO (1991):
n = (Z1 - α/2)2 x p (1 - p) d2
Trong đó: n là số mẫu tối thiểu cần đạt được P là tỷ lệ gia súc nhiễm bệnh dự kiến
(1- p) là tỷ lệ gia súc không nhiễm bệnh
d là độ chính xác mong muốn (< 0,05 hay hệ số tin cậy 95%) (Z1 - α/2)2 có giá trị 1,96
3.4.1.2. Phương pháp lấy mẫu máu
- Sát trùng vùng tĩnh mạch cổ trâu bằng cồn 700. Dùng xilanh nhựa 3 ml lấy máu tĩnh mạch cổ trâu. Mỗi trâu lấy không quá 1 ml máu, tiêm ngay 0,2 ml máu vào phúc mạc cho chuột bạch, sau đó dùng phiết kính 3 tiêu bản
máu. Ghi ký hiệu mẫu; thể trạng trâu; triệu chứng lâm sàng (nếu có); tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu. Bảo quản ở 40C.
3.4.1.3. Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
- Lấy mẫu máu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 370C, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh ly tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầu. Bảo quản huyết thanh ở - 200C.
3.4.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên các mẫu máu trâuđã thu thập đã thu thập
3.4.2.1. Phương pháp ứng dụng Kit chẩn đoán bệnh
Trên cùng một mẫu máu được hợp cả 3 phương pháp: ứng dụng Kit tự chế tạo theo nguyên lý CATT, Kit nhập ngoại và tiêm truyền chuột bạch để chẩn đoán bệnh cho đàn trâu của huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang. Từ đó, so sánh và đánh giá hiệu quả chẩn đoán bệnh của Kit tự chế tạo.
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer, lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl). Sau đó cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng
que nhựa trộn đều. Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và đánh giá kết quả.
3.4.2.2. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
Dùng máu tươi tiêm trực tiếp cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông). Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu, tiêm vào phúc mạc. Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền. Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp xem tươi.
3.4.3. Một số quy định trong nghiên cứu đặc điểm dịch tễ
* Quy định về tuổi trâu
- Tuổi trâu nghiên cứu được phân ra theo 4 lứa tuổi: + ≤ 2 năm tuổi
+ > 2 – 5 năm tuổi + > 5 – 8 năm tuổi + > 8 năm tuổi
* Các tháng theo dõi trong năm
Chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong các tháng 1,2,3,4,5.
3.4.4. Xây dựng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng
3.4.4.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng mẫn cảm của T. evansi với một số thuốc trị tiên mao trùng trên chuột bạch
Thí nghiệm được bố trí trên 160 chuột/4 loại thuốc, mỗi loại sử dụng ở 3 mức liều: thấp hơn, cao hơn và đúng liều khuyến cáo của nhà sản xuất.
40 chuột gây nhiễm T. evansi được bố trí thí nghiệm đối với một loại thuốc. Sau gây nhiễm 3 ngày (máu ngoại vi có khoảng 80 - 100 TMT /vi trường) thì chia thành 2 lô:
- Lô thí nghiệm (gồm 30 chuột): mỗi mức liều tiêm cho 10 chuột. - Lô đối chứng (gồm 10 chuột): không tiêm thuốc.
Sau dùng thuốc, hàng ngày trích máu đuôi chuột kiểm tra bằng phương pháp soi tươi để xác định thời gian sạch tiên mao trùng trong máu. Nếu cả 10 chuột đều sạch tiên mao trùng, sau 15, 20, 30 ngày không thấy tiên mao trùng xuất hiện trở lại thì xác định thuốc có tác dụng tốt với tiên mao trùng ở liều sử dụng. Nếu có chuột không sạch tiên mao trùng hoặc sạch nhưng sau đó xuất
hiện trở lại tiên mao trùng thì thuốc có hiệu lực thấp ở liều sử dụng. So sánh với kết quả theo lô đối chứng.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả thí nghiệm này cho phép xác định được thuốc nào còn hiệu lực cao với tiên mao trùng, thuốc nào đã có thể bị tiên mao trùng quen và kháng lại.
3.4.4.2. Phương pháp nghiên cứu biện pháp trị bệnh tiên mao trùng * Xây dựng phác đồ điều trị:
- Qua nghiên cứu về khả năng mẫn cảm của T. evansi trên chuột bạch, chúng tôi lựa chọn thuốc có hiệu lực cao, an toàn để xây dựng 3 phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu. Mỗi phác đồ gồm có:
+ Thuốc diệt tiên mao trùng + Thuốc trợ tim
+ Thuốc trợ sức, trợ lực.
* Thử nghiệm phác đồ điều trị trên diện hẹp:
Mỗi phác đồ được điều trị thử nghiệm cho 3 trâu (có kết quả dương tính với T. evansi bằng Kit chẩn đoán). Xét nghiệm máu trâu sau 5, 10, 15 và 20 ngày điều trị để kiểm tra tác dụng của phác đồ điều trị bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
* Thử nghiệm trên diện rộng:
Sau khi thử nghiệm trên diện hẹp, tiếp tục thử nghiệm trên số lượng trâu nhiễm tiên mao trùng nhiều hơn để xác định hiệu quả của mỗi phác đồ điều trị bệnh. Xét nghiệm máu trâu để xác định hiệu lực điều trị bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch. Từ đó, chọn một phác đồ tốt nhất để áp dụng rộng rãi ở các địa phương.
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008), trên phần mềm Excel 2003.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Ứng dụng Kit chẩn đoán để xác định tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang ở trâu tại huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang
4.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở một số xã thuộc huyện Yên Sơn, tỉnhTuyên Quang Tuyên Quang
Trong thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 257 mẫu máu trâu tại 4 xã của huyện Yên Sơn gồm: Lang Quán, Tứ Quận, Hùng Lợi và Chân Sơn. Mỗi trâu được kiểm tra bằng Kit tự chế và Kit nhập ngoại. Sau đó những mẫu máu dương tính được tiêm truyền chuột bạch để phát hiện TMT. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại một số xã thuộc huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang
Địa phương (xã) Số trâu kiểm tra (con)
Kit tự chế Kit nhập ngoại MI Số trâu (+) Tỷ lệ (%) Số trâu (+) Tỷ lệ (%) Số trâu có TMT (con) Tỷ lệ (%) Xã Lang Quán 76 9 11,84 9 11,84 9 11,84 Xã Tứ Quận 44 8 18,18 8 18,18 8 18,18 Xã Hùng Lợi 98 6 6,12 6 6,12 6 6,12 Xã Chân Sơn 39 5 12,82 5 12,82 5 12,82 Tính chung 257 28 10,89 28 10,89 28 10,89
Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
- Khi kiểm tra 257 mẫu huyết thanh của trâu tại 4 xã thuộc huyện Yên Sơn bằng Kit tự chế, có 28/257 mẫu huyết thanh dương tính, tỷ lệ nhiễm TMT là 10,89%.
- Tương tự như Kit tự chế, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng phát hiện tiên mao trùng của Kit nhập ngoại, trong 257 mẫu huyết thanh trâu, có 28 trâu nhiễm TMT T. evansi.
Sau khi xác định được 28 trâu có huyết thanh dương tính khi sử dụng Kit CATT nhiễm TMT, chúng tôi tiến hành lấy máu những trâu này tiêm truyền sang chuột bạch. Kết quả cho thấy: cả 28 mẫu đều phát hiện được TMT
Trypanosoma evansi thông qua xét nghiệm máu chuột bạch sau 7 – 10 ngày
tiêm truyền. Cụ thể là:
Xã Lang Quán có 9 mẫu phát hiện tiên mao trùng; xã Tứ Quận có 8 mẫu phát hiện tiên mao trùng; xã Hùng Lợi có 6 mẫu phát hiện tiên mao trùng; xã Chân Sơn có 5 mẫu phát hiện tiên mao trùng.
Từ kết quả trên ta có thể khẳng định rằng việc ứng dụng Kit chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có hiệu quả và độ chính xác cao do tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính tương đương với tỷ lệ phát hiện TMT bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
Kết quả cụ thể về tình hình nhiễm TMT ở trâu tại các xã như sau:
Nơi có tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất là xã Tứ Quận (18,18%), sau đó, đến xã Chân Sơn (12,82%), Lang Quán (11,84%), Hùng Lợi (6,12%). Trong đó:
- Xã Lang Quán kiểm tra 76 trâu có 9 con bị nhiễm, chiếm tỷ lệ 11,84%. - Xã Tứ Quận kiểm tra 44 trâu có 8 con bị nhiễm, chiếm tỷ lệ 18,18%. - Xã Hùng Lợi kiểm tra 98 trâu có 6 con bị nhiễm, chiếm tỷ lệ 6,12%. - Xã Chân Sơn kiểm tra 39 trâu có 5 con bị nhiễm, chiếm tỷ lệ 12,82%. Sở dĩ tỷ lệ nhiễm TMT của các xã khác nhau là do nhiều yếu tố như điều kiện tự nhiên, chăm sóc, quản lý của người chăn nuôi ở các xã là không giống nhau. Một số xã ở gần đường quốc lộ, người dân chủ yếu làm nghề buôn bán, trâu, bò ít phải lao tác nặng nhọc. Mặt khác, số lượng cây cối, bụi rậm ít nên ruồi, mòng không có điều kiện phát triển và đốt, hút