Với tổng số 60 mảnh lá sử dụng cho biến nạp, chúng tôi thu đƣợc 114 dòng thuốc lá T0 sống sót và ra rễ trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Lựa chọn ngẫu nhiên 18 dòng thuốc lá T0 trồng trên giá thể TN1 và chăm sóc trong điều kiện nhà lƣới. Tỷ lệ sống sót thu đƣợc đạt 100%.
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu lá của các dòng thuốc lá chuyển gen đã ra rễ và phát triển tốt trên giá thể sau 3 tuần và kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GSH1-F/GSH1-R.
Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng đối chứng (không chuyển gen) đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cho thấy trên tất cả các mẫu chỉ có một băng duy nhất (Hình 3.11).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Băng xuất hiện rõ và đậm nét chứng tỏ DNA tổng số tách chiết đƣợc khá nguyên vẹn, tỉ lệ DNA đứt gãy thấp và có thể sử dụng cho phản ứng PCR.
Hình 3.11. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng thuốc lá
wt: cây thuốc lá không chuyển gen; 1-9: các dòng thuốc lá chuyển gen
Kết quả phân tích và kiểm tra sản phẩm PCR các dòng thuốc lá chuyển gen đƣợc thể hiện ở Hình 3.12 và Bảng 3.2.
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá với cặp mồi GSH1-F/GSH-R
(+): đối chứng dƣơng; (-): đối chứng âm; M: Marker DNA 1Kb; wt: Cây thuốc lá không chuyển gen; 1- 19 : các dòng thuốc lá chuyển gen
Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng thuốc lá biến nạp cấu trúc pBI121/GSH1 cho thấy có 8 mẫu dƣơng tính với phản ứng nhân bằng cặp mồi đặc hiệu. Tất cả các mẫu này đều xuất hiện 1 băng duy nhất ở kích thƣớc khoảng 2,2 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc chủa cấu trúc GSH1 thiết kế
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
ban đầu (đối chứng +, hình 3.14), chứng tỏ cấu trúc GSH1 đã đƣợc chuyển thành công vào 8 dòng thuốc lá trên (Hình 3.14).
Bảng 3.2: Kết quả phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR Cấu trúc chuyển Tổng số mẫu phân tích Số mẫu dƣơng tính với PCR Tỷ lệ dòng dƣơng tính với PCR (%) GSH1 18 8 44,4
Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ cây dƣơng tính qua sàng lọc PCR đạt 44,4% (8/18 cây) và 55,6% tổng số cây vƣợt qua chọn lọc nhƣng âm tính với kết quả PCR.
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng phát triển của các dòng cây chuyển gen trên môi trường chứa As
Lấy những cây thuốc lá dƣơng tính có cùng ngày tuổi nuôi cấy, chiều dài cây khoảng 3 cm đặt vào môi trƣờng ra rễ RMTL có bổ sung As (V) (Na2HAsO4) với các nồng độ khác nhau: 0 M, 50 M, 100 M, 150 M. Sau 10 ngày ta thu đƣợc kết quả thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá sự phát triển của các dòng thuốc lá trên
môi trƣờng chứa As nồng độ khác nhau
Nồng độ As ( M)
Cây WT Cây chuyển gen
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 50
100
150
Ở môi trƣờng ra rễ không chứa As thì cây đối chứng (ĐC) và cây chuyển gen (CG) đều phát triển là tƣơng đƣơng nhau. Tuy nhiên khi bổ sung As vào môi trƣờng ra rễ thì mức độ phát triển của cây đã có sự khác biệt. Ở nồng độ As là 50 M cây ĐC phát triển không bằng cây CG, lá vẫn xanh nhƣng không mọc rễ, không tạo lá mới. Trong khi đó ở cùng một nồng độ As này thì cây CG cho rễ phát triển dài, các mảnh lá xanh đậm, cây mọc thêm lá
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
mới, có sức sống cao. Đây đƣợc coi là nồng độ cho cây CG có thể tích lũy đƣợc As và phát triển tốt trên môi trƣờng này. Khi tăng nồng độ As lên 100 M, cây CG vẫn phát triển đƣợc tuy nhiên rễ không dài, lá không xanh, lá bắt đầu chuyển màu không đƣợc xanh tốt nhƣ ở nồng độ 50 M. Trong khi đó, cây ĐC có hiện tƣợng thối rễ,các mảnh lá úa vàng, dấu hiệu cho sự ngừng phát triển và dần chết đi. Biều hiện này càng thấy rõ hơn ở cả cây ĐC và cây CG khi cấy trên môi trƣờng ra rễ có bổ sung 150 M As. Dù cây đƣợc chuyển gen nhƣng do ngƣỡng As khá cao nên cây không phát triển đƣợc. Qua bảng 3.3 ta nhận thấy các cây CG và cây ĐC có sƣ khác nhau rõ ràng khi cấy cây trên môi trƣờng ra rễ có bổ sung As. Những cây CG thì sống đƣợc trên môi trƣờng có bổ sung As có nồng độ từ 50-100 M. Còn những cây ĐC thì không phát triển và dần chết đi trên môi trƣờng chứa As. Điều này chứng tỏ rằng những dòng cây thuốc lá mang gen GSH1 có khả năng khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có As tốt hơn cây không chuyể gen. Kết quả này sẽ tiếp tục đƣợc phân tích khả năng hấp phụ tích lũy As trong cây, từ đó biết đƣợc mức đô biểu hiện và hoạt tính của gen GSH1 tái tổ hợp, đƣa ra đƣợc hƣớng úng dụng trong các cây trồng khác.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
1. Đã thiết kế đƣợc vector chuyển gen pBI121 mang gen GSH1 đã đổi mã biểu hiện phù hợp thực vật và biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tumefaciens EHA105.
2. Đã chuyển thành công gen GSH1 vào giống thuốc lá K326 và thu đƣợc 114 dòng cây ra rễ trên môi trƣờng chứa kháng sinh chọn lọc.
3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen GSH1 ở 18 cây chuyển gen bằng phản ứng PCR cho thấy 8/18 dòng cây cho kết quả dƣơng tính (chiếm tỷ lệ 44,4%).
4. Các dòng cây chuyển gen bƣớc đầu thể hiện khả năng phát triển tốt hơn cây đối chứng trên môi trƣờng chứa As, đặc biệt ở ngƣỡng nồng độ As là 50µM.
Đề nghị
Để phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đề xuất một số ý kiến nhƣ sau:
- Tiếp tục phân tích các dòng cây chuyển gen, đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển.
- Đánh giá khả năng tích lũy As của các dòng cây chuyển gen trong môi trƣờng ô nhiễm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Thị An, Chu Thị Thu Hà (2005) Ảnh hƣởng kim loại nặng trong đất và thời gian phơi nhiễm lên sự tích tụ kim loại ở một số cây rau. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. NXB KH&KT: 361-364.
2. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005) Nghiên cứu và phát triển vaccine
ăn đƣợc trong thực vật. Tạp chí công nghệ sinh học 3: 133-142.
3. Hoàng Văn Bính (2007) Độc chất học công nghiệp và dự phòng nhiễm độc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Đặng Đình Kim (2010) Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu ứng dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm KLN tại các vùng khai thác khoáng sản. Đề tài cấp nhà nƣớc KC08.04/06-10.
5. Võ Văn Minh (2007) Khả năng hấp thụ Cadimi trong đất của cỏ Vetiver. Thông báo khoa học, ĐHSP Đà Nẵng.
6. Nguyễn Quốc Thông, Đặng Đình Kim, Lê Lan Anh, Trần Văn Tựa (1999) khả năng tích lũy KLN Cr, Ni, và Zn của bèo tây trong xử lý nƣớc thải công nghiệp. Báo cáo Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội.
7. Nguyễn Quốc Thông, Đặng Đình Kim, Vũ Đức Lợi, Lê Lan Anh, Trần Dụ Chi, Vũ Văn Vụ (2003) Hấp thụ KLN Cr và Ni từ nƣớc thải mạ điện của cây cải soong. Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội.
8. Lê Thế Thự, Vũ Trọng Thiện, Đặng Ngọc Chánh và cs (2006) Điều tra ô nhiễm arsen trong nƣớc ngầm ở 3 tỉnh miền Tây Nam Bộ (Long An, Tiền
Giang, Bến Tre). Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh 10(4): 116-121.
9. Trần Văn Tựa (2007) Nghiên cứu sử dụng các loài thực vật thủy sinh điển hình cho xử lý nƣớc thải công nghiệp chế biến thực phẩm. Đề tài cấp viện KH&CN Việt Nam 2005-2006.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Tài liệu tiếng Anh
10. Abernathy CO, Thomas DJ (2003) Health effects and risk assessment of arsenic. Journal of Nutrition 133: 1536-1539.
11. Andrew Meharg (2005) Venomous Earth - How Arsenic Caused The
World's Worst Mass Poisoning, Macmillan Science. Macmillan Science 192.
12. Aposhian HV, Zakharyan RA, Petrick JS, Sampayo A, Radabaugh TR, Wildfang EK, Healy SM. and Aposhian MM (1999) Methylarsonous acid [MMA(III)], the most toxic and neglected biotransformant of inorganic arsenic. Chapman and Hall, New York 43.
13. Baker AJM, McGrath SP, Reeves RD, Smith JAC (2000) Metal hyperac cumulator plants: A review of the ecoloy and physiology of a biochemical resource for phytoreme diation of metal-polluted soils. Phytoremediation of Contaminated Soil and Water Florida: 85-107.
14. Bako L, Umeda M, Tiburcio AF, Schell J, Koncz C (2003) The VirD2
pilot protein of Agrobacterium-transferred DNA interacts with the TATA box (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- binding protein and a nuclear protein kinase in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 10108- 10113.
15. Citovsky V, Wong ML, Zambryski P (1989) Cooperative interaction of Agro bacterium ViE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 86: 1193-1197.
16. Chen T, Liao XY, Huang Z, Lei M, Li WX, Mo Ly, An ZZ, Wei CY, Xiao XY and Xie H (2006) Phytoremendiation of arsenic contaminated soil in
china. Method Biotech 23: 391-400.
17. Cobbett CS (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiol 123: 825-832.
18. Cole DJ (1983) Oxidation of xenobiotics in plants. Prog Pest Biochem Technol 3: 199-253.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
19. Coleman JOD, Blake - Kalff MMA, Davies TGE (1997) Detoxification of xenobiotics by plants: Chemicalmodification and vacuolar compartimentation.
Trends Plant Sci 2: 144-151.
20. Dhankher OP, Li Y, Rosen BP, Shi J, Salt D, Senecoff JF, Sashti NA, Meagher RB (2002) Engineering tolerance and hyperaccumulation of arsenic in plants by combining arsenate reductase and gamma-glutamylcysteine
synthetase expression. Nat Biotechnol 20: 1140-1145.
21. Ding ZS, Zhao M, Jing YX, Li LB and Kuang TY (2006) Efficient agro bacterium mediated transformation of rice by phosphomannose isomerase mannose selection. Plant Molecular Biology Reporter 24: 295-303.
22. Douglas KT (1987) Mechanisms of action of gluta-thione-dependent
enzymes. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology
59: 103-167.
23. Foyer CH, Souriau N, Perret S, Lelandais M, Kunert KJ, PruvostC, Jouanin L (1995) Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to
photoinhibition in poplar trees. Plant Physiol 109: 1047-1057.
24. Gallego SM, Benavides MP, Tomaro ML (1996) Effect of heavymetal ion excess on sunflower leaves: evidence for involvementof oxidative stress.
Plant Sci 121: 151-159.
25. Gasic K, Korban SS (2007) Transgenic Indian mustard (Brassica juncea) plants expressing an Arabidopsis phytochelatin synthase (AtPCS1) exhibit enhanced As and Cd tolerance. Plant Mol Biol 64: 361-369.
26. Gelvin SB (2003) Agrobacterium and plant transformation: the biology
behind the “gene - jockeying” tool. Microbiologyand Molecular Biology
67: 16-37.
27. Guo JB, Dai XJ, Xu WZ, Ma M (2008) Overexpression of GSH1 and AsPCS1 simultaneously increase the tolerance and accumulation of cadmium
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
28. Gushima H, Yasuda S, Soeda E, Yokota M, Kondo M and Kimura A (1984) Complete nucleotide se-quence of the E.coli glutathione synthetase
gsh-11. Nucleic Acids Res 12: 9299-9307.
29. Hooykaas VS, Hooykass PJJ, Schilperoot RA (1984) Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium
tumefaciens. Nature 311: 763-764. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30. Huang CS, Moore WR, Meister A (1988) On the active site thiol of γ- glutamylcysteine synthetase: relationships to catalysis, inhibition, and regulation. Proc natl Acad sci USA 8: 2464-2468.
31. Kotrba P, Najmanova J, Macek T, Ruml T, Mackova M (2009) Genetically modified plants in phytoremediation of heavy metal and metalloid
soil and sediment pollution. Biotech Adv 27: 799-810.
32. Larsson A, Orrenius S, Holmgren A and Mannervik B (1983) Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects.
Raven Press, New York.
33. Ma JF, Tamai K, Ichii M, Wu GF (2002) A rice mutant defective in Si
uptake. Plant Physiol 130: 2111-2117.
34. Ma JF, Tamai K, Yamaji N, Mitani N, Konishi K, Katsuhara M, Ishiguro
M, Murata Y, Yano M (2006) A silicon transporter in rice. Nature 440: 688-
691.
35. Ma LQ, Komar KM, Tu C, Zhang W, Cai Y (2001) A fern that
hyperacumulate arsenic. Nature 223: 409-579.
36. Mc Grath SP, Zhao FJ (2003) Phytoextraction of metals and metalloids
from contaminated soils. Curr Opin Biotechnol 14: 277-282.
37. Meister A (1988) Glutathione metabolism and its selective modification. J
Biol Chem 263: 17205-17208.
38. Meister A and Anderson ME (1983) Glutathione in: Ann rev biochem
(Snell EE, Boyer PD, Meister A and Richardson CC). Annual Reviews 52:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
39. Meng YL, Liu Z, Rosen BP (2004) As(III) and Sb(III) uptake by GlpF and
efflux by ArsB in Escherichia coli. J Biol Chem 279: 18334-18341.
40. Murata K and Kimura A (1982) Cloning of a gene responsible for the biosynthesis of glutathione in Escherichia coli B. Appl Environ Microbiol
44(6): 1444-1448.
41. Pilon-Smits E (2005) Phytoremediation annu rev. Plant biol 56: 15-39.
42. Prasad MNV and H Freitas (2003) Metal hyperaccumulation in plants – Biodiversity prospecting for phytoremediation technology. Electr J. Biotech 6(3): 275-321.
43. Sandermann H (1994) Higher plantmetabolismof xenobiotics: The „green
liver‟ concept. Pharmacogenetics 4: 225-241.
44. Shelmerdine PA, Colin RB, McGrath SP and Young SD (2009) Modelling phytoremediation by the hyperaccumulating fern, Pteris vittata, of soils
historically contaminated with arsenic. Env Pollution 157(5): 1589-1596.
45. Song WY, Park J, Mendoza-Cozatl DG, Sute-Grotemeyer M, Shim D, Hoertensteiner S, Geisler M, Weder B, Rea PA, Rentsch D, Schroeder JI, Lee Y, Martinoia E (2010) Arsenic tolerance in Arabidopsis is mediated by two ABCC-type phytochelatin transporters. Proc Natl Acad Sci USA 107(49): 21187-21192. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
46. Watanabe K, Yamano Y, Murata K and Kimura A (1986) The nucleotide sequence of the gene for y- glutamylcysteine synthetase of Escherichia coli.
Nucleic Acids Res 14: 4393-4000.
47. Weckx JEJ, Clijsters HMM (1996) Oxidative damage and defenseme chanisms in primary leaves ofPhaseolus vulgarisas a result ofroot assimilation
of toxic amounts of copper. Physiol Plant 96: 506–512.
48. Weckx JEJ, Clijsters HMM (1997) Zn phytotoxicity induces oxidative
stress in primary leaves of Phaseolus vulgaris. PlantPhysiol Biochem 35: 405-
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
49. Wei SH, Zhou QX, Kovl PV (2006) Flowering stage characteristics of cadmium hyperaccumulator Solanum nigrum L. and their significance to
phytoremediation. Sci of the Total Env 369: 441-446.
50. WHO (World health organization) Genneva, “Inorganic lead environment
health criteria 165” IPCS (International program on chemical safely)
51. Williams PN, Price AH, Raab A, Hossain SA, Feldmann J, Meharg AA (2005) Variation in arsenic speciation and concentration in paddy rice related
to dietary exposure Environ. Environ sci Technol 39(15): 5531-5540
52. Winski SL and Carter DE (1995) Interactions of rat red blood cell
sulfhydryls with arsenate and arsenite. Journal of Toxicological Environment
and Health 46: 379-397.
53. Xu XY, McGrath SP, Zhao FJ (2007) Rapid reduction of arsenate in the
medium mediated by plant roots. New Phytol 176: 590-599.
54. Zhao FJ, Ma JF, Meharg AA, McGrath SP (2009) Arsenic uptake and
metabolism in plants. New Phytol 181(4): 777-794.
55. Zhu YG, Rosen BP, (2009) Perspectives for genetic engineering for the phytoremediation of arsenic-contaminated environments: from imagination to reality?. Curr Opin Biotech 20: 220-224.
56. Pilon-Smits EAH, Hwang S, Lytle CM, Zhu Y, Tai JC, Bravo RC, Chen Y, Leustek T, Terry N (1999) Overexpression of ATP sulfurylase in Indian mustard leads to increased selenate uptake, reduction and tolerance. Plant Physiol 119: 123-132.
57. Sies H (Ed) (1985) Oxidative Stress. Academic Press, London.
58. Steffens JC (1990) The heavy metal-binding peptides of plants. Annu Rev
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Sơ đồ vector pBI121/GUS
Phụ lục 2. Trình tự gen GSH1 tổng hợp nhân tạo
Trình tự nucleotide của gen GSH1 gồm 2037 bp nhƣ sau:
ATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCCTTTGCAGTGGTTTGAGTCTAGGACGTACAATGAACACATA AGGGATGAAGGTATCGAGCAGTTGTTGTATATTTTCCAAGCTGCTGGTAAAAGAGACAATGACCCT CTTTTTTGGGGAGACGAGCTTGAGTACATGGTTGTAGATTTTGATGATAAGGAGAGAAATTCTATG CTCGACGTTTGCCATGACAAGATACTCACTGAGCTTAATATGGAGGATTCGTCCCTTTGTGAGGCT AACGATGTGAGTTTTCACCCTGAGTATGGCCGGTATATGTTAGAGGCAACACCAGCTTCTCCATAT TTGAATTACGTGGGTAGTTACGTTGAGGTTAACATGCAAAAAAGACGTGCCATTGCAGAATATAAG CTATCTGAATATGCGAGACAAGATAGTAAAAATAACTTGCATGTGGGCTCCAGGTCTGTCCCTTTG ACGCTGACTGTCTTCCCGAGGATGGGATGCCCCGACTTTATTAACATTAAGGATCCGTGGAATCAT AAAAATGCCGCTTCCAGGTCTCTGTTTTTACCCGATGAAGTCATTAACAGACATGTCAGGTTTCCT AACTTGACAGCATCCATCAGGACCAGGCGTGGTGAAAAAGTTTGCATGAATGTTCCCATGTATAAA GATATAGCTACTCCAGAAACGGATGACTCCATCTACGATCGAGATTGGTTTTTACCAGAAGACAAA GAGGCGAAACTGGCTTCCAAACCGGGTTTCATTTATATGGATTCCATGGGTTTTGGCATGGGCTGT TCGTGCTTACAAGTGACCTTTCAGGCACCCAATATCAACAAGGCACGTTACCTGTACGATGCATTA GTGAATTTTGCACCTATAATGCTAGCCTTCTCTGCCGCTGCGCCTGCTTTTAAAGGTTGGCTAGCC GACCAAGATGTTCGTTGGAATGTGATATCTGGTGCGGTGGACGACCGTACTCCGAAGGAAAGAGGT GTTGCGCCATTACTACCCAAATACAACAAGAACGGATTTGGAGGCATTGCCAAAGACGTACAAGAT AAAGTCCTTGAAATACCAAAGTCAAGATATAGTTCGGTTGATCTTTTCTTGGGTGGGTCGAAATTT TTCAATAGGACTTATAACGACACAAATGTACCTATTAATGAAAAAGTATTAGGACGACTACTAGAG AATGATAAGGCGCCACTGGACTATGATCTTGCTAAACATTTTGCGCATCTCTACATAAGAGATCCA GTATCTACATTCGAAGAACTGTTGAATCAGGACAACAAAACGTCTTCAAATCACTTTGAAAACATC CAAAGTACAAATTGGCAGACATTACGTTTTAAACCCCCCACACAACAAGCAACCCCGGACAAAAAG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ GATTCTCCTGGTTGGAGAGTGGAATTCAGACCATTTGAAGTGCAACTATTAGATTTTGAGAACGCT GCGTATTCCGTGCTCATATACTTGATTGTCGATAGCATTTTGACCTTTTCCGATAATATTAACGCA TATATTCATATGTCCAAAGTATGGGAAAATATGAAGATAGCCCATCACAGAGATGCTATCCTATTT GAAAAATTTCATTGGAAAAAATCATTTCGCAACGACACCGATGTGGAAACTGAAGATTATTCTATA AGCGAGATTTTCCATAATCCAGAGAATGGTATATTTCCTCAATTTGTTACGCCAATCCTATGCCAA AAAGGGTTTGTAACCAAAGATTGGAAAGAATTAAAGCATTCTTCCAAACACGAGAGACTATACTAT TATTTAAAGCTAATTTCTGATAGAGCAAGCGGTGAATTGCCAACAACAGCAAAATTCTTTAGAAAT TTTGTACTACAACATCCAGATTACAAACATGATTCAAAAATTTCAAAGTCGATCAATTATGATTTG CTTTCTACGTGTGATAGACTTACCCATTTAGACGATTCAAAAGGTGAATTGACATCCTTTTTAGGA GCTGAAATTGCAGAATATGTAAAAAAAAATAAGCCTTCAATAGAAAGCAAATGTTAA
Gen này mã hóa cho protein bao gồm 678 aa với trình tự nhƣ sau:
MGLLALGTPLQWFESRTYNEHIRDEGIEQLLYIFQAAGKRDNDPLFWGDELEYMVVDFDDKER NSMLDVCHDKILTELNMEDSSLCEANDVSFHPEYGRYMLEATPASPYLNYVGSYVEVNMQKRR AIAEYKLSEYARQDSKNNLHVGSRSVPLTLTVFPRMGCPDFINIKDPWNHKNAASRSLFLPDE VINRHVRFPNLTASIRTRRGEKVCMNVPMYKDIATPETDDSIYDRDWFLPEDKEAKLASKPGF IYMDSMGFGMGCSCLQVTFQAPNINKARYLYDALVNFAPIMLAFSAAAPAFKGWLADQDVRWN VISGAVDDRTPKERGVAPLLPKYNKNGFGGIAKDVQDKVLEIPKSRYSSVDLFLGGSKFFNRT YNDTNVPINEKVLGRLLENDKAPLDYDLAKHFAHLYIRDPVSTFEELLNQDNKTSSNHFENIQ STNWQTLRFKPPTQQATPDKKDSPGWRVEFRPFEVQLLDFENAAYSVLIYLIVDSILTFSDNI NAYIHMSKVWENMKIAHHRDAILFEKFHWKKSFRNDTDVETEDYSISEIFHNPENGIFPQFVT PILCQKGFVTKDWKELKHSSKHERLYYYLKLISDRASGELPTTAKFFRNFVLQHPDYKHDSKI SKSINYDLLSTCDRLTHLDDSKGELTSFLGAEIAEYVKKNKPSIESKC
Phụ lục 3. Thành phần các môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh cây