Vector pBluescript II SK-GSH1 đƣợc tinh sạch và cắt bằng cặp enzyme
giới hạn XbaI và SacI nhằm thu cấu trúc gen GSH1 có đầu so le. Tƣơng tự vector chuyển gen pBI121 cũng đƣợc xử lý bằng cùng một cặp enzyme XbaI và SacI để loại bỏ gen GUS và tạo ra đầu tƣơng ứng có thể liên kết bổ sung
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
với hai đầu của gen GSH1. Kết quả phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% nhƣ trên hình 3.1, 3.2 cho thấy: gen GSH1 đã đƣợc cắt ra khỏi vector pBluescript II SK-GSH1 và đồng thời vector pBI121 đƣợc mở vòng loại bỏ gen GUS. Cấu trúc gen GSH1 và vector pBI121 đã mở vòng đƣợc thu lấy bằng tinh sạch từ bản gel agarose.
Hình 3.1. Kết quả xử lý vector
pBluescript II SK-GSH1 bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và
SacI trên gel agarose 1% M: Thang marker DNA 1 kb
Hình 3.2. Kết quả xử lý vector
pBI121 bằng cặp enzyme giới hạn
XbaI và SacI trên gel agarose 1% M: Thang marker DNA 1 kb
11,2 kb 2 kb 2,5 kb 2,2 kb 3 kb 1,8 kb 2 kb
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch thể hiện ở hình 3.3 cho thấy sản phẩm tƣơng đối sạch không bị đứt gãy, đúng với kích thƣớc nhƣ tính toán lý thuyết đảm bảo các yêu cầu thí nghiệm tiếp theo.
Sau khi tinh sạch gen GSH1 và vector pBI121 đã loại GUS, chúng tôi tiến hành phản ứng lai để ghép nối đoạn gen GSH1 vào vector pBI121 bằng T4 ligasetạo vector tái tổ hợp pBI121/GSH1.
Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng ghép nối sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để tạo dòng, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Sau khi đƣợc biến nạp dịch vi khuẩn đƣợc cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin, kết quả biến nạp nhƣ hình 3.4
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch
1: Gen GSH1; 2: Vector pBI121, M: Marker DNA 1 kb
2,2 kb
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.4. d E.coli DH5α
Kết quả biến nạp vào tế bào E. coli DH5α trên hình 3.4 thể hiện rõ có nhiều khuẩn lạc sống sót đều mọc trên môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc kanamycin bƣớc đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc này đã đƣợc biến nạp vector tái tổ hợp.
*Kiểm tra khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pBI121/GSH1 Phản ứng colony - PCR
Chƣa thể khẳng định đƣợc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc kanamycin là các dòng mang plasmid tái tổ hợp
pBI121/GSH1. Chúng có thể là các khuẩn lạc mang các plasmid tự đóng
vòng, hoặc mang gen đích bị đứt gãy. Vì vậy, để có thể chọn lọc dòng khuẩn lạc mang vector chứa gen đích, chúng tôi thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi GSH1-F1/M1 có khả năng nhân một phần gen GSH1 cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1 kb. Hình 3.5 cho thấy các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 5 cho kết quả dƣơng tính PCR với kích thƣớc sản phẩm phù hợp tính toán theo lý thuyết, chúng có thể mang vector pBI121/GSH1.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi GSH1-
F1/GSH1-M1
(+): đối chứng dƣơng; 1-5: các dòng khuẩn lạc E. coli; M: Marker DNA 1 kb.
Phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn XbaI và SacI (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để khẳng định thêm các dòng khuẩn lạc trên mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid của các dòng trên. Sản phẩm thu đƣợc thực hiện phản ứng cắt bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và SacI.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và SacI
1, 2, 3: plasmid của các dòng khuẩn lạc; M: Marker DNA 1kb
2,2 kb 2 kb
10 kb 11,2 kb
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Theo lý thuyết khi cắt bằng enzyme giới hạn XbaI và SacI thì plasmid