tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pBI121 mở vòng và gen GSH1. Kết quả cắt của chúng tôi đƣợc kiểm tra trên agarose 0,8 % cho 2 vạch băng phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết (Hình 3.6).
Từ kết quả kiểm tra colony – PCR và xử lý enzyme giới hạn, chúng tôi có thể khẳng định vector tái tổ hợp pBI121/GSH1 đã đƣợc thiết kế thành công. Đây là nguồn vật liệu cho tạo chủng Agrobacterium phục vụ chuyển gen thực vật.
3.1.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121/GSH1 pBI121/GSH1
Khoảng 5-10 µl plasmid pBI121 tái tổ hợp đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens EHA105 bằng phƣơng pháp xung điện. Sản phẩm của quá trình biến nạp đƣợc nuôi trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc có chứa kanamycin, rifamycin, chloramphenicol. Kết quả thu đƣợc những khuẩn lạc Agrobacterium mang vector pBI121/GSH1 sống đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc. Để khẳng định thêm, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony - PCR với cặp mồi
GSH1-F1/M1. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR A. tumefaciens
1-5: các dòng khuẩn lạc; M: Marker DNA 1 kb.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Qua kết quả thu đƣợc ở trên, cho thấy có 4 trong 5 dòng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 1 kb, đúng với kích thƣớc dự tính. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo đƣợc chủng A. tumefaciens EHA105 mang plasmid tái tổ hợp pBI121/GSH1. Các dòng khuẩn này đƣợc sử dụng phục vụ chuyển gen vào cây trồng.