Các mảnh lá đƣợc cắt từ cây thuốc lá tái sinh in vitro với kích thƣớc khoảng 1cm2
và cảm ứng trên môi trƣờng tái sinh GM. Sau 2 ngày nuôi trên môi trƣờng GM, mảnh lá sẽ đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 10 phút, các mảnh lá sẽ đƣợc đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trƣờng GM 2 ngày trong điều kiện tối. Sau đó, các mảnh lá tiếp tục đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime và kháng sinh chọn lọc kanamycin.
Có thể thấy, khi cấy chuyển sang môi trƣờng GM có chứa kanamycine, các mảnh lá bắt đầu phình lên và phát triển tạo cụm chồi (Hình 3.8).
Hình 3.8. Mảnh lá thuốc lá K326 trên môi trƣờng đồng nuôi cấy (A) và bắt đầu cảm ứng tạo cụm chồi trên môi trƣờng GM +Km50 (B).
các đặt trong
hoặc có mọc chồi nhƣng lại rụng dần (Hình 3.9).
A B
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.9. Sự phát triển của các mảnh lá trên môi trƣờng chọn lọc GM + Km50 sau 3 tuần theo dõi; (A) Mẫu đối chứng không chuyển gen; (B) Mẫu chuyển gen.
Những chồi mập, xanh xuất hiện sau 4 - 5 tuần chọn lọc đạt kích thƣớc 3 - 4 cm đƣợc tách ra và chuyển sang môi trƣờng ra rễ (RMTL) để tạo cây hoàn chỉnh. Sau 2 tuần trên môi trƣờng ra rễ các chồi con đạt kích thƣớc khoảng 5 - 7 cm, phát triển bình thƣờng. Do đó, chúng tôi cho rằng những chồi và cây phát triển trên môi trƣờng chọn lọc chứa 50 mg/l kanamycin là những cá thể giả định chuyển gen. Kết quả chuyển gen đƣợc thể hiện ở Hình 3.10 và Bảng 3.1.
Hình 3.10. Cây con 2 tuần trên môi trƣờng ra rễ (A) và cây ra in vivo 1 tháng (B).
A B
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen và chọn lọc in vitro trên cây thuốc lá K326
Lần biến
nạp mẫu biến Tổng số nạp
Số mẫu tạo
cụm chồi Số chồi sống sót trên môi trƣờng GM chọn lọc Số chồi tạo rễ trên môi trƣờng RM chọn lọc 1 30 15 60 56 2 30 18 62 58 Tổng cộng 60 33 122 114
Dựa vào bảng số liệu trên, ta có thể thấy có 50-60% tổng số mẫu tạo chồi. Thuốc lá là một đối tƣợng có khả năng đáp ứng khá cao đối với chuyển gen. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển gen và khả năng tái sinh còn phụ thuộc vào cấu trúc vector chuyển. Trong nghiên cứu này, giả định cây chuyển gen là cây có khả năng tái sinh và ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc ngƣỡng thì tỷ lệ chuyển gen đạt đƣợc tới xấp xỉ 1,9 cây/mảnh lá. Đây là một tỷ lệ tƣơng đối cao so với các công bố trƣớc. Các kết quả nghiên cứu cho thấy cấu trúc và kích thƣớc gen chuyển có ảnh hƣởng tới khả năng tiếp nhận của cây. Trong thí nghiệm này, cấu trúc vector chuyển có kích thƣớc trung bình. Vì thế có thể giải thích phần nào về đáp ứng chuyển nạp cấu trúc gen tƣơng đối tốt.