Ti-plasmid là một đoạn phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lƣợng phân tử bằng 3-5% so với trọng lƣợng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Sử dụng Agrobacterium chuyển gen gặp khó khăn do Ti-plasmid của
Agrobacterium lớn (200kb). Ti-plasmid chứa các gen khối u gây bất lợi cho
thực vật, cản trở quá trình tái sinh bình thƣờng ở thực vật [14]. Các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau trong khi công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới hạn. Mặt khác, khi chuyển các Ti-plasmid này vào E. coli, chúng sẽ không có khả năng tái bản trong E. coli. Chính vì vậy phải tạo nên các plasmid cải biến. Do đó, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể: gồm 2 plasmid cùng tồn tại trong Agrobacterium sau tiếp hợp: một plasmid khép kín (vector chuyển gen) và Ti-plasmid (vector bổ trợ - helper Ti-plasmid). Plasmid khép kín đặc trƣng bao gồm 1 hoặc cả 2 vùng (phải và trái) lặp lại của T-DNA, vùng có thể sao mã và khởi động trong nhiều chủ thể và gen chỉ thị chọn lọc làm cho plasmid có thể hoạt động trong
E. coli và Agrobacterium. Vector bổ trợ có các gen vir, gen khởi đầu phiên
mã của Agrobacterium (Ori A) và không có các vùng T-ADN. Sau khi tiếp hợp, 2 plasmid cùng tồn tại một áp lực chọn lọc trong Agrobacterium. Khi
Agrobacterium nhiễm vào cây bị thƣơng, các gen vir của vector bổ trợ tƣơng
tác với vùng phải của Ti-plasmid khép kín theo chiều trans để chuyển T-DNA vào genome thực vật [43].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
1.3. Glutathione và gen GSH1
Glutathione (GSH) là một hợp chất dạng thiol có khối lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo thành từ ba peptide axit glutamic (Glu), cysteine (Cys) và glycine (Gly). GSH đƣợc tìm thấy rộng rãi ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Các nhà khoa học [37], [32], [57], [22] đã chỉ ra rằng GSH có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào. Nó là chất chống oxy hóa nội sinh, tham gia trực tiếp vào việc trung hòa các gốc tự do và các hợp chất có tính oxy hóa, cũng nhƣ duy trì các chất chống oxy hóa ngoại sinh nhƣ vitamin C và E [2]. GSH đƣợc sử dụng trong các phản ứng trao đổi chất và sinh hóa trong tế bào nhƣ tổng hợp và sửa chữa DNA, tổng hợp protein, vận chuyển axit amin, hoạt hóa enzyme. Trong thực vật, GSH tham gia vào việc bảo vệ các tế bào và cây khỏi các stress sinh học và phi sinh học. Nó là một thành phần quan trọng của chu trình glutathione-ascorbate, một hệ thống làm giảm độc tính của hydrogen peroxide (H2O2). Ngoài ra GSH có nhiều vai trò liên quan tới khả năng chống chịu và hấp thụ kim loại nặng của tế bào. Nó bảo vệ các tế bào khỏi tác hại của quá trình oxy hóa gây ra bởi kim loại nặng [24], [47], [48]. GSH là tiền tố trực tiếp của phytochelatins (PCs). PCs là một loại peptide liên kết kim loại liên quan đến khả năng hấp thụ và tích lũy kim loại nặng của tế bào thực vật [58]. Cả GSH và PCs đều có khả năng tạo phức chất với kim loại nặng nhƣ Cd, Cu và As, đồng thời tích lũy chúng trong không bào [17]. Gasic và Korban (2007) thấy rằng tăng cƣờng biểu hiện của PCs trong cây mù tạt Ấn Độ chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu với As nhƣng không tăng cƣờng tích tụ As một cách đáng kể [25]. Việc thiếu các phản ứng trong sự tích lũy có thể do thực tế là tổng hợp PCs cũng bị hạn chế bởi việc sản xuất các GSH.
GSH đƣợc tổng hợp thông qua hai phản ứng đòi hỏi sử dụng năng lƣợng của ATP với sự tham gia của hai enzyme γ-glutamylcysteine synthetase (γ-ECS) (GSH1) và glutathione synthetase (GSH2). Đầu tiên, GSH1 xúc tác hình thành liên kết peptide giữa nhóm cacboxyl của L-Glu với nhóm amino của L-Cys để tạo thành γ-glutamylcysteine (γ-EC).
L-Glu + L-Cys + ATP → L-γ-Glu-L-Cys + ADP + Pi.
Tiếp theo, GSH2 xúc tác sự hình thành của GSH từ γ-EC và glycine [23].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
L-γ-Glu-L-Cys + Gly + ATP → L-γ-Glu-L-Cys-Gly + ADP + Pi
Các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng ở thực vật, cụ thể là ở
Arabidopsis thaliana và Brassica juncea, GSH1 nằm hoàn toàn ở lục lạp, trong khi đó phần lớn GSH2 xuất hiện ở tế bào chất và chỉ một phần nhỏ đƣợc vận chuyển vào lục lạp [43]. Các gen mã hóa GSH1 và GSH2 của E. coli cũng đã đƣợc tách dòng [40] và giải trình tự [46], [28].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng GSH1 là enzyme đóng vai trò chính trong việc điều hòa quá trình sinh tổng hợp GSH [30], [38]. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu ảnh hƣởng của việc tăng cƣờng biểu hiện gen GSH1 đến khả năng chống chịu của cây trồng trong các điều kiện bất lợi. Zhu và cộng sự (1999) thấy rằng khi tăng cƣờng biểu hiện gen
GSH1 có nguồn gốc từ E. coli trên cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea), cây chuyển gen có khả năng chống chịu Cd cao hơn hẳn cây đối chứng. Hàm lƣợng GSH, PCs thu đƣợc ở cây chuyển gen cũng lớn hơn cây đối chứng. Đặc biệt, nồng độ Cd thu đƣợc ở chồi cây chuyển gen cao hơn từ 40% - 90%, tuy nhiên lại không ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của cây. Nhƣ vậy, tăng cƣờng biểu hiện của gen GSH1 làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH và PCs, dẫn đến tăng khả năng chống chịu và tích lũy Cd của cây.
Dhankher và cộng sự (2002) đã tạo đƣợc các dòng Arabidopsis biểu hiện gen GSH1 có nguồn gốc từ E. coli dƣới sự điều khiển của promoter ACT2p với khả năng tăng cƣờng tính chống chịu As cao hơn so với đối chứng. Hơn nữa, các tác giả còn thấy rằng khi tăng cƣờng biểu hiện đồng thời gen GSH1 và gen arsenate reductase (ArsC), cây chuyển gen có khả năng chống chịu As cao hơn nhiều lần so với cây chỉ chuyển mình gen GSH1 và cây đối chứng [20]. Khi đƣợc trồng trên môi trƣờng có As, các cây này có khối lƣợng chồi tƣơi lớn hơn 4 -17 lần và tích lũy đƣợc lƣợng As lớn hơn 2 -3 lần so với đối chứng. Một nghiên cứu gần đây của Guo và cộng sự (2008) cũng cho thấy các dòng A. thaliana đƣợc chuyển đồng thời hai gen AtPCS1
và GSH1có khả năng tích lũy lƣợng Cd và As gấp hai lần so với các dòng chỉ chuyển đơn gen [27]. Mặc dù nghiên cứu này cho thấy tính khả thi của việc đồng thời biểu hiện PCS và GSH1 giúp cho việc tăng cƣờng tích tụ và đồng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
thời tăng tính chống chịu As ở cây chuyển gen, tuy vậy không có dữ liệu trực tiếp cho thấy As đƣợc lƣu giữ trong không bào hay còn lại trong tế bào chất.
Từ các cơ sở trên, có thể thấy rằng gen GSH1 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp GSH và tăng cƣờng biểu hiện GSH1 trong thực vật là một hƣớng đi đầy tiềm năng trong việc tạo ra các cây trồng chuyển gen siêu hấp thụ và tích lũy kim loại nặng nhằm góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trƣờng. Hiện nay ở Việt Nam, chƣa có công bố nào về việc phân lập cũng nhƣ chuyển gen GSH1 vào thực vật. Vì vậy, đề tài này là cơ sở cho việc tạo ra các cây trồng có khả năng chống chịu và tích lũy As cũng nhƣ các kim loại nặng khác ở Việt Nam.
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU