3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.5. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
để xác ựịnh bệnh tắch vi thể chúng tôi lấy mẫu và nhuộm tiêu bản theo phương pháp HE.
- Phương pháp làm tiêu bản vi thể ựược thực hiện theo quy trình tẩm ựúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE):
+ Cố ựịnh bệnh phẩm: mục ựắch ựể giết chết tổ chức; ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, bệnh phẩm phải ngập trong formol, ựể sao 10 ngày là có thể sử dụng ựược.
+ Vùi bệnh phẩm: tạo ra chất nền cho tổ chức dễ cắt; tiến hành lần lượt các bước sau:
* Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình ngâm mẫu, cắt thành các miếng tổ chức theo chiều dài có ựộ dài 4-5 mm. Cho vào khuôn ựúc bằng nhựa, ựem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong vòng 24 giờ ựể rửa sạch formol.
* Khử nước và khử cồn: cho bệnh phẩm ựã rủa nước lần lượt vào: Cồn I : 3h Cồn II : 3h Cồn III : 4h Cồn IV : 12h Xylen I : 4h Xylen II : 4h Xylen II: 12h Mục ựắch ựể khử hết nước và khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
* Khử Xylen: cho qua hệ thống parafin ựã ổn ựịnh (parafin có từ 3-5% sáp ong ựã nấu, ựảo nhiều lần thành một nôi trường ựồng nhất, ổn ựịnh, ựặc, chắc, không lẫn tạp chất). Gồm 3 lọ:
Parafin I : 6h Parafin II : 6h Parafin III : 12h
Mục ựắch ựể khử hết Xylen trong tổ chức , trong tổ chức chỉ còn Parafin thấm ựều trong các kẽ mô bào.
- đúc Block: ựể vùi miếng tổ chức trong moi trường Parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
+ đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block và ựổ nhanh parafin lỏng vào block. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc và chắc là ựược.
+ Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn rồi gắn nhãn ựể tránh nhầm lẫn.
- Cắt dán mảnh:
Cắt dán mảnh bằng máy Microtom với ựộ dàn mảnh cắt khoảng 3-5 maicromet, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức là ựược.
Tãi mảnh: sau khi cắt ựược, dùng pank kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước, hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48oc rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 37oc ựến khi bệnh phẩm khô là ựược.
- Nhuộm tiêu bản: gồm các bước:
+ Bước 1: khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 3-5 phút
Xylen II : 3-5 phút Xylen III : 3-5 phút
+ Bước 2: khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn I : 1 phút
Cồn II : 1 phút Cồn III : 1 phút
Cồn IV : 1 phút
+ Bước 3: khử cồn: ựể tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 15 phút. + Bước 4: nhuộm Haematoxylin ( nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước, lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản. để trong vòng 8-10 phút, sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước chảy 3-5 phút cho hết Haematoxylin thừa. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì phải nhúng tiêu bản qua lọ NaHCO3 1% (30 giây). Nếu màu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl) trong 30 giây. Sau khi ựiều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. + Bước 5: nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa dưới vòi nước chảy khoảng 3-5 phút cho hết Eosin thừa.
+ Bước 6: tẩy nước: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn I : 15 giây
Cồn II : 15 giây Cồn III : 15 giây Cồn IV : 15 giây
+ Bước 7: tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản qua lọ ựựng Xylen I trong thời gian 1-2 phút, sau ựó ựưa qua lọ ựựng Xulen II (ựể trong tủ ấm) trong 2 phút.
+ Bước 8: gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.