L ỜI MỞ ĐẦU
5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG VI TẢO LÀM THỨC ĂN
2.2.3. Các loại môi trường dinh dưỡng sử dụng trong thí nghiệm
KNO3 89,6mg/l KH2PO4 5,6mg/l NaSiO3. 9H2O 30mg/l Na2EDTA 4,36mg/l FeCl3. 6H2O 3,15mg/l CuSO4. 56H2O 0,01mg/l ZnSO4. 6H2O 0,022mg/l CoCl3. 6H2O 0,01mg/l MnCl2. 6H2O 0,18mg/l MaMoO4. 6H2O 0,006mg/l Vitamin : Thianin (B1) 0,1mg/l (B6) 0,0005mg/l Riboflavin (B12) 0,0005mg/l 2.2.3.2. Môi trường TT3 KNO3 70mg/l KH2PO4 6mg/l Na2SiO3. 9H2O 5mg/l EDTA 5mg/l
Acid citric C6H8O7. H2O 7mg/l FeCl3. 6H2O 2mg/l 2.2.3.3. Môi trường HBM-95 [7] - Dung dịch 1: KNO3: 30 mg/l KH2PO4: 10 mg/l Na2EDTA: 10 mg/l - Dung dịch 2: Na2SiO3. 9 H2O: 10 mg/l - Dung dịch 3: FeCl3. 6H2O: 5 mg/l 2.2.4. Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Các thí nghiệm ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của tảo Thalassiosira sp.
Các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml với 4 thí nghiệm về
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo
Thalassiosira sp. nhập nộị
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển tảo
Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí 6 lô thí nghiệm tương ứng với các mức độ mặn: 10,15, 20,
25, 30, 35ppt. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
MĐBĐ: 10 x 104 tb/ml
Môi trường nuôi: F2
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa).
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của mật độ tảo ban đầu lên sự phát triển
tảo Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí 6 lô thí nghiệm tương ứng với các mật độ: 5 x104 ; 10 x 104 ; 15 x 104 ; 20 x 104 ; 30 x 104 ; 40 x 104 tb/ml. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa) Môi trường nuôi: F2
Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự phát
Thí nghiệm được tiến hành với 3 môi trường nuôi (TT3, F2, HBM - 95), 3 lần lặp lạị Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
MĐBĐ: Rút ra từ thí nghiệm về mật độ ban đầu. Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa).
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự phát triển tảo
Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí ở các mức cường độ ánh sáng như sau: 1500, 2500, 3500, 4500, 5000 lux. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Điều kiện nuôi: MĐBĐ: Rút ra từ thí nghiệm về mật độ ban đầu. Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa)
Môi trường dinh dưỡng : Rút ra từ thí nghiệm về dinh dưỡng.
2.2.4.2. Lưu giữ giống tảo Thalassiosira sp.
* Thí nghiệm:Lưu giữ Thalassiosira sp. trong môi trường nuôi lỏng
Bảng 2. 1. Các thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp đối với tảo Thalassiosira sp. trong dịch nuôi lỏng.
Lô thí nghiệm Điều kiện
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Môi trường dinh dưỡng HBM -
95
HBM - 95 F2 F2 TT3 TT3
Nhiệt độ 7-80C 150C 7-80C 150C 7-80C 150C
Ghi chú: Mật độ tảo lưu giữ: 30 x vạn tb/ml, 50ml/1 ống nghiệm. Độ mặn: 30ppt. Thời gian lưu giữ: 2 tuần
* Thí nghiệm: Lưu giữ Thalassiosira sp. trong môi trường nuôi bán lỏng
Bảng 2. 2. Các thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp đối với tảo Thalassiosira sp. trong dịch nuôi bán lỏng.
Lô thí nghiệm Điều kiện
Lô 7 Lô 8 Lô 9 Lô 10 Lô 11 Lô 12 Môi trường dinh dưỡng HBM -
95
HBM - 95 F2 F2 TT3 TT3
Ghi chú: Mật độ tảo lưu giữ: 30 x vạn tb/ml, 50ml/1 ống nghiệm. Độ mặn: 30ppt.
Thời gian lưu giữ: 2 tuần
Sau 2 tuần lưu giữ, tiến hành nuôi sinh khối ở các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, với mật độ ban đầu: 2 x vạn tb/ml
Môi trường dinh dưỡng: HBM-95 hoặc F2, TT3 (tương ứng với môi trường dinh dưỡng được dùng khi lưu giữ tảo)
Độ mặn: 30 ppt
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng
Chỉ tiêu xác định: môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp cho loàị Ngoài ra còn xác định dịch nuôi lỏng, bán lỏng có phù hợp để lưu giữ Thalassiosira
sp. không.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Tảo giống thuần chủng
Lưu giữ trong các điều kiện
khác nhau Môi trường lỏng (dịch nuôi lỏng) Môi trường bán lỏng (dịch nuôi lỏng và agar) MTĐ F2 ở nhiệt độ 15oC MTĐ F2 ở nhiệt độ 7 -8oC MTĐ TT3 ở nhiệt độ 15oC MTĐ TT3 ở nhiệt độ 7 -8oC MTĐ HBM ở nhiệt độ 15oC MTĐ HBM ở nhiệt độ 7 -8oC
Hình 2. 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm lưu giữ tảo giống Thalassiosira sp.
2.2.4.3. Các thí nghiệm nuôi thu sinh khối ngoài trờị
* Thí nghiệm: Nuôi sinh khối thu toàn bộ (batch culture) tảo Thalassiosira sp.
Ứng dụng các kết quả đạt được ở mục 2.2.4.1 để nuôi thu sinh khối giống tảo
Thalassiosira sp. Thí nghiệm được tiến hành trong túi nilon 50 lít trong suốt.
Điều kiện nuôi:
- Nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên
- Môi trường dinh dưỡng, độ mặn, mật độ ban đầu ứng dụng mục ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển quần thể tảo Thalassiosira sp.
- Muối dinh dưỡng được cho vào nước nuôi chỉ một lần/đợt (1ml dung dịch
muối dinh dưỡng/1 lít nước nuôi).
- Thời điểm thu hoạch: Cuối pha logarit đầu pha gia tốc âm
* Thí nghiệm: Nuôi sinh khối thu từng phần (Semi-continous culture) tảo
Thalassiosira sp.
Điều kiện nuôi:
- Nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên
- Môi trường dinh dưỡng, độ mặn, mật độ ban đầu ứng dụng mục ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển quần thể tảo Thalassiosira sp.
- Cuối pha logait, đầu pha gia tốc âm tiến hành thu hoạch theo các thể tích
20%, 40%, 60% (theo từng lô) so với thể tích thí nghiệm. Thể tích nước được bổ sung đúng bằng thể tích thu hoạch. Muối dinh dưỡng cũng được bổ sung theo thể tích thu hoạch (1ml dung dịch muối dinh dưỡng/1 lít nước bổ sung).
- Thu hoạch ở 3 tỷ lệ: 20%, 40%, 60%
Kiểm chứng: Nhân sinh khối, kiểm tra số lượng và sự phát
triển (tốc độ sinh trưởng - µ) của vi tảo
Điều kiện lưu giữ thíchhợp cho tảo
Thalassiosira sp Thí nghiệmlưu giữ trong thời
Hình 2. 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi thu sinh khối tảo Thalassiosira sp.
2.2.5. Phương pháp xác định các chỉ tiêu
2.2.5.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Việc xác định số lượng tế bào tảo được tiến hành bằng cách đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu Neubauer, buồng đếm có 9 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô
vuông nhỏ, mỗi ô vông nhỏ có diện tích 0.1mm2 và độ sâu buồng đếm là 0.1 mm.
Phương pháp lấy mẫu tảo:
- Mẫu tảo được lấy một lần trong ngày vào 8 giờ sáng để đếm mật độ tế bàọ
- Lượng mẫu tảo được lấy là 5ml/lần.
Phương pháp đếm tế bào tảo:
Giống tảo Thalassiosira sp.
Ánh sáng tự nhiên
Nhiệt độ tự nhiên
Môi trường dinh dưỡng thích hợp Nước đã xử lý Độ mặn thích hợp Sục khí 24/24h Mật độ ban đầu thích hợp Túi ni lông 50 lít
Thu hoạch tại thời điểm cuối pha logarit đầu pha gia tốc âm
Các thông số đánh giá: mật độ tế bào, tốc độ sinh trưởng, sản lượng.
Lắc đều mẫu tảo, dùng pipet paster hút mẫu tảo xịt vào buồng đếm đã được đậy
sẵn lamen, để lắng một lúc rồi đưa vào thị trường kính để đếm, đếm ở vật kính 40, mỗi mẫu tảo được đếm 3 lần.
Công thức tính mật độ tế bào tảo:
Nếu mật độ tảo thưa (dưới 500 vạn tb/ml) thì:
Mật độ tế bào (tb/ml) = số tế bào đếm được trong 4 ô lớn/4 x vạn tb
Nếu mật độ tế bào dày (trên 500 vạn tb/ml) thì:
Mật độ tế bào (tb/ml) = số tế bào đếm được trong 5 ô lớn/5 x vạn tb
Công thức tính tốc độ tăng trưởng của tảo [4]
µ = ln (N1 /N0) /t
Trong đó : µ: Tốc độ tăng trưởng.
N1 :Mật độ tảo tại thời điểm t1 .
N0:Mật độ tảo tại thời điểm t0.
t: Khoảng thời gian giữa 2 lần xác định mật độ (t = t1- t0).
2.2.6. Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường
Đo cường độ ánh sáng: dùng máy đo Ana-F1 của Nhật.
Đo độ mặn: dùng khúc xạ kế (refractometer) cầm tay, độ chính xác 1 ‰
Đo nhiệt độ: Đo bằng nhiệt kế, độ chính xác 10C
Đo pH: Đo bằng máy đo pH cầm tay, độ chính xác 0,5
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các thông số như giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, vẽ đồ thị, phân tích phương
sai một yếu tố được xử lý bằng chương trình Data analysis-Excel 2003. Giá trị MĐCĐ được kiểm định thống kê bằng SPSS 15.0.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của tảo
Thalassiosira sp.
3.1.1. Ảnh hưởng của độ mặn khác nhau lên phát triển của tảo
Thalassiosira sp.
Độ mặn là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến vùng phân bố và tốc độ tăng trưởng của tảọ Thalassiosira sp. là loại tảo sống trong môi trường nước
mặn vì vậy thí nghiệm được tiến hành ở các độ mặn khác nhau: 15ppt; 20ppt; 25ppt; 30ppt và 35ppt. Mật độ ban đầu: 10 vạn tb/ml; Môi trường: F2; Cường độ ánh sáng: 3500 – 4000lux; Nhiệt độ: 16 – 200C. Kết quả thu được trình bày ở Hình 3.1 và Bảng 3.1.
Hình 3. 1: Ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển tảo Thalassiosira sp. Ngày đầu tiên của quá trình thí nghiệm tảo phát triển khá tốt ở độ mặn 25-30ppt
cùng đạt 15.7 ± 0.60 vạn tb/ml và thấp nhất ở độ mặn 15ppt là 11.8 ± 0.66. Ở độ mặn
25ppt, 30ppt và 35ppt tảo đạt cực đại vào ngày thứ 9 sớm hơn các lô còn lại đạt cực đại vào ngày thứ 10. MĐCĐ của 3 lô 25ppt (121.5 ± 7.07); 30ppt (141.6± 3.67); 35ppt (113.9 ± 1.30) cao hơn so với 2 lô 15ppt (96.3 ± 3.33) và 20ppt (101.6 ± 4.19). Sự tàn lụi ở các lô 25ppt, 30ppt, 35ppt cũng chậm hơn so với hai lô 15ppt và 20ppt.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0 160.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ngày Mât độ (vạn tb/ml) Lô 15%o Lô 20%o Lô 25%o Lô 30%o Lô 35%o
Bảng 3. 1: Ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển tảo Thalassiosira sp. Thời 15ppt 20ppt 25ppt 30ppt 35ppt gian N ± SE µ N ± SE µ N ± SE µ N ± SE µ N ± SE µ (ngay) (x vạn tb) (x vạn tb) (x vạn tb) (x vạn tb) (x vạn tb) 1 10 ± 0.00 0.00 10 ± 0.00 0.00 10 ± 0.00 0.00 10 ± 0.00 0.00 10 ± 0.00 0.00 2 11.8 ± 0.66 0.17 12.5 ± 0.18 0.22 15.7 ± 0.60 0.45 15.7 ± 0.60 0.45 13.5 ± 0.55 0.30 3 17.1 ± 0.57 0.37 18.9 ± 0.21 0.41 21.0 ± 0.25 0.29 25.0 ± 0.40 0.47 21.9 ± 1.53 0.48 4 20.9 ± 3.63 0.20 26.1 ± 3.56 0.32 39.6 ± 3.30 0.63 45.2 ± 3.76 0.59 37.2 ± 1.16 0.53 5 34.7 ± 3.63 0.51 39.0 ± 2.44 0.40 65.0 ± 1.78 0.50 73.9 ± 5.14 0.49 60 ± 0.21 0.48 6 51.0 ± 7.66 0.39 52.0 ± 7.31 0.29 92.8 ± 4.86 0.36 98.8 ± 3.86 0.29 78.1 ± 3.60 0.26 7 61.7 ± 3.72 0.19 65.7 ± 2.72 0.23 101.1 ± 3.70 0.09 105.1 ± 2.69 0.06 92.7 ± 8.32 0.17 8 74.2 ± 4.42 0.18 79.0 ± 2.25 0.18 116.3 ± 10.66 0.14 124.7 ± 9.80 0.17 104.1 ± 4.24 0.12 9 87.2 ± 4.61 0.16 92.2 ± 2.69 0.15 121.5 ± 7.07C 0.04 141.6 ± 3.67d 0.13 113.9 ± 1.30bc 0.09 10 96.3 ± 3.33a 0.10 101.6 ± 4.19ab 0.10 100.9 ± 0.23 -0.19 114.2 ± 3.47 -0.22 91.8 ± 1.31 -0.22 11 83.6 ± 1.06 -0.14 85.4 ± 0.87 -0.17 96.9 ± 0.61 -0.04 100.7 ± 10.74 -0.13 78.9 ± 6.11 -0.15 12 62.5 ± 6.20 -0.29 75.3 ± 5.90 -0.13 76.9 ± 7.08 -0.23 94.4 ± 8.40 -0.06 70.1 ± 7.89 -0.12 13 32.9 ± 0.23 -0.64 53.4 ± 2.31 -0.34 59.9 ± 2.40 -0.25 89.5 ± 8.13 -0.05 54.5 ± 5.60 -0.25 14 24.1 ± 2.00 -0.31 43.8 ± 3.98 -0.20 44.5 ± 13.15 -0.30 69.6 ± 5.50 -0.25 43.9 ± 0.83 -0.22 15 18.0 ± 5.01 -0.29 21.0 ± 4.04 -0.74 35.6 ± 5.23 -0.22 48.4 ± 6.73 -0.36 41.5 ± 0.46 -0.06 16 8.1 ± 1.27 -0.80 10.9 ± 0.50 -0.66 21.7 ± 1.51 -0.50 32.2 ± 0.20 -0.41 28.5 ± 0.63 -0.38
Ghi chú: Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SE) (vạn tb/ml). Các chữ cái viết kèm minh họa bên trên khác nhau chỉ sự
Theo phân tích thống kê tại Phụ lục 1 thì sự khác nhau về MĐCĐ ở lô 30ppt
so với các lô còn lại là có ý nghĩa (P<0.05). Theo như kết quả trên cho thấy tảo
Thalassiosira sp. ưa độ mặn từ 20 đến 35ppt, nhưng cực thuận từ 25 đến 30ppt.
Tốc độ tăng trưởng ngày ở các lô thí nghiệm cũng khác nhaụ Tương tự như
mật độ thì tốc độ tăng trưởng theo ngày của tảo ở lô 30ppt dao động khoảng: µ = 0.13
÷ 0.59 cao hơn so với lô 15ppt là µ = 0.1 ÷ 0.51. Ba lô 25ppt, 30ppt, 35ppt tăng trưởng
âm vào ngày thứ 10; hai lô 15ppt và 20ppt tăng trưởng âm vào ngày thứ 11.
Tảo Thalassiosira sp. phát triển được ở độ mặn dao động từ 15ppt ÷ 35ppt
chứng tỏ rằng loại tảo này có khả năng chịu đựng được dao động của độ mặn khá cao. Tuy nhiên nhìn vào đồ thị thấy ở độ mặn 15ppt và 20ppt tảo phát triển chậm hơn so
với các độ mặn khác từ ngày nuôi thứ 3 trở đị Đường cong sinh trưởng của quần thể
tảo ở lô 25ppt và 30ppt tương đối đều và ổn định, sau khi đạt cự đại mật độ của tảo
không giảm mạnh như các lô thí nghiệm còn lạị
MĐCĐ tảo ở lô 30ppt là 141.6± 3.67 vạn tb/ml lại lớn hơn so với ở lô 35ppt:
113.9 ± 1.30 vạn tb/ml.Vì vậy, độ mặn thích hợp nhất được chọn trong thí nghiệm này cho tảo Thalassiosira sp. là 30ppt. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Lê Chí Viễn (1994) đối với loài Ch. calcitrans (tảo si líc trung tâm) phát triển tốt ở độ
mặn 25 ÷ 30ppt.
3.1.2. Ảnh hưởng của mật độ ban đầu lên sự phát triển của tảo
Thalassiosira sp.
Việc xác định mật độ ban đầu thích hợp rất có ý nghĩa trong thực tế sản xuất.
Tùy thuộc vào nhu cầu sản xuất, chúng ta có thể tăng mật độ ban đầu ở mức độ nào đó
nhằm rút ngắn thời gian tảo đạt sinh khối cực đạịTrong trường hợp khác, cần duy trì
lượng tảo nuôi trong thời gian dài thì cần một mật độ nuôi thích hợp.
Thí nghiệm bố trí 5 lô mật độ ban đầu: 1 vạn; 5 vạn; 10 vạn; 15 vạn; và 20 vạn
tb/ml. Môi trường F2; cường độ ánh sáng 3500 – 4000lux; Nhiệt độ 16 – 200C; Độ mặn 30ppt. Kết quả được diễn tả qua Hình 3.2 và Bảng 3.2.
Vào những ngày đầu của quá trình thí nghiệm các lô có mật độ ban đầu cao tảo
phát triển mạnh hơn so với các lô có mật độ thấp là 1 vạn, 5 vạn. Bên cạnh đó MĐCĐ ở 3 lô có mật độ ban đầu cao là 10 vạn, 15 vạn và 20 vạn cũng đạt sớm hơn vào ngày
cao thì mật độ tế bào tăng càng nhiều và thời gian đạt MĐCĐ càng ngắn do số lượng
tế bào ban đầu tham gia vào quá trình phân cắt càng nhiều thì số lượng tế bào tạo ra
càng nhiềụ Khi cung cấp mật độ ban đầu càng cao sẽ rút ngắn được thời gian đạt MĐCĐ, tuy nhiên MĐCĐ của tảo muốn đạt cao nhất thì chưa chắc cần mật độ ban đầu
cao nhất.
MĐCĐ của lô 10 vạn: 138.3 ± 2.24 vạn tb/ml đạt cao nhất so với các lô còn lại,
lô 1 vạn: 84.1 ± 3.41 vạn tb/ml; lô 5 vạn: 100.4 ± 2.66 vạn tb/ml; lô15 vạn: 103.5 ±