L ỜI MỞ ĐẦU
5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG VI TẢO LÀM THỨC ĂN
5.2. Trong nước
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu nuôi vi tảo biển làm thức ăn cho các động
vật chỉ mới được tiến hành gần đây cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm biển,
mục đích cung cấp thức ăn cho nhu cầu sản xuất con giống một số đối tượng như: Tôm
Sú, Diệp Quạt, Bào Ngư, Trai Ngọc, Cá Ngựa, Ốc Hương…
Từ năm 1974, trường ĐHTS đã thử nghiệm nuôi tảo S. costatum trong phòng thí nghiệm (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [7]. Sau đó các năm 1976 – 1984, Viện nghiên
cứu Hải sản , Hải Phòng đã có nhiều nghiên cứu về tảo silic hỗn hợp và S.costatum của
kỹ sư Lê Viễn Chí và Vũ Dũng. Năm 1989, trại giống Non Nước (liên doanh Vatech)
Đà Nẵng đã phân lập và nuôi đại trà S.costatum làm thức ăn ấu trùng tôm đạt kết quả.
Tháng 11/1989, nhóm nghiên cứu đề tài của Trung tâm nghiên cứu Thuỷ sản III đã phân lập được S.costatum tại vùng biển Nha Trang và nuôi đại trà làm thức ăn cho tôm sú đạt kết quả tốt (Nguyễn Thị Xuân Thu, 1991) [12].Trại sản xuất tôm giống Qui Nhơn đã rất thành công trong việc sử dụng tảo Skeletonema costatum làm thức ăn cho các giai đoạn ấu trùng tôm. Tương tự, các trại tôm ở Hạ Long, Cẩm Phả cũng đã sử
dụng tảo S.costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm he và đã nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng giai đoạn Zoea1 – Mysis lên 36 – 43%, trong khi đó sử dụng thức ăn là giáp xác thì tỷ lệ sống đạt 17% (Đoàn Văn Đẩu, 1986) [5].
Trung tâm nghiên cứu Thủy Sản III đã tiến hành nuôi các loài tảo Isochrysis galbana, Nanochlorosis oculata, chaetoceros muelleri sử dụng làm thức ăn để nuôi ấu trùng Điệp Quạt (Chalamis nobilis) và đạt được những kết quả khả quan. Viện nghiên cứu Thủy Sản Hải Phòng cũng đã thành công trong việc sử dụng C.calcitrans, chlamydomonas và Dunnalliela salina trong ương ấu trùng loài Trai Ngọc Mã Thị
(Pinctada martensii) (Chí và cộng sự, 1996) [2].
Hoàng Thị Bích Mai (1995) [7] đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, nhiệt độ, ánh sáng, hàm lượng muối dinh dưỡng lên sinh trưởng, phát triển và đưa ra qui trình nuôi hai loài tảo silic là Skeletonema costatum và chaetoceros sp. làm thức ăn cho ấu
trùng tôm sú.
Viện Hải Dương học Nha Trang đã phân lập và nuôi hai loài tảo đáy Navicula sp.
và Nizschia sp. cung cấp cho ấu trùng bào ngư giai đoạn veliger (Báo cáo tổng kết đề
tài của phòng thực vật,1998).
Lục Minh Diệp (1999) [4] khi nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ phân bón khác
nhau và các tỷ lệ thu hoạch khác nhau lên sự phát triển hỗn hợp của tảo biển tự nhiên thấy rằng thành phần loài ưu thế của tảo biển tự nhiên thay đổi theo tỷ lệ pha loãng và
thay đổi theo tỷ lệ phân bón.
Từ những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Phạm Thị Lam Hồng
(1998) [6] cho thấy loài Nannochlorosis oculata phát triển ở nước ta tốt nhất trong môi trường THO4; ưa thích độ mặn cao từ 30 – 35ppt và ở tỷ lệ thu hoạch 60%, loài
trọng lượng khô; Lipid chiếm 12,35%, cho sản lượng cao nhất trong ba tỷ lệ thu hoạch
5%,, 30%, 60%. Kết quả này đã được ứng dụng để nuôi sinh khối tảo Nannochlorosis oculata ngoài trời làm thức ăn cho Trùng bánh xe và nuối ấu trùng cá Chẻm (Lates calcarifer) tại Trường Đại học Nha Trang.
Tiếp theo đó, khi phong trào nuôi tôm sú phát triển rộng khắp ở một số tỉnh như
Khánh Hòa, Bình Thuận, Đà Nẵng…thì phong trào nuôi tảo silic làm thức ăn cho tôm
cũng phát triển theọ Những năm đầu, việc nuôi tảo silic làm thức ăn cho tôm đã mang lại hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên, do phong trào phát triển tự phát, người nuôi không có
sự hiểu biết, giống lấy từ tự nhiên còn tạp, nước thải của nuôi tôm thải ra môi trường không được xử lý làm môi trường bị ô nhiễm, ảnh hưởng đến chất lượng tảo, từ đó
việc gây nuôi tảo khuê làm thức ăn cho tôm sú không mang lại hiệu quả như mong
muốn.
Vài năm trở lại đây, phong trào nuôi các đối tượng hải đặc sản đã và đang phát
triển, nhu cầu về thức ăn tươi sống như vi tảo là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu sản
xuất giống hải sản, các trại sản xuất đã tiến hành nuôi thu sinh khối các loài vi tảo là thức ăn cho động vật nuôi và vi tảo đã mang lại thành công đáng kể cho các trại sản
xuất giống. Các công trình nghiên cứu về sản xuất giống Hải sản đã thành công phải
kể đến là Trung tâm nghiên cứu thủy sản III đã nuôi tảo N.oculata, Platymonas và chaetoceros muelleri làm thức ăn cho ấu trùng điệp quạt, Viện nghiên cứu Hải sản Hải
Phòng đã thành công trong việc sử dụng loài tảo Chaetoceros calcitrans, chlamydomonas và Dunalliela salina trong ương nuôi ấu trùng trai ngọc (P.matensii) và còn rất nhiều công trình nghiên cứu các đối tượng hải sản khác trong cả nước đã và
đang sử dụng các loài vi tảo trong việc sản xuất giống nhân tạọ Vi tảo đã và đang ngày càng được nuôi với thành phần loài ngày càng đa dạng và phong phú.
Để góp phần cho việc nuôi sinh khối, lưu giữ và nhân giống các loài vi tảo nhằm đảm bảo cung cấp đầy đủ, kịp thời lượng tảo tốt, phục vụ cho việc ương nuôi ấu trùng
các đối tượng hải sản nuôi thì việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học, ảnh hưởng các
yếu tố sinh thái lên sự phát triển của tảo là rất cần thiết. Đề tài “Ảnh hưởng cuả một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Thalassiosira sp. nhập nội và thử nghiệm nuôi sinh khối” cũng nhằm mục đích đó.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 12 năm 2009 đến tháng 06 năm 2010
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu
■ Các thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái lên sự phát triển của tảo
Thalassiosira sp. được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh lý sinh thái, khoa Nuôi
trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang.
■ Thí nghiệm nuôi sinh khối trong túi ni lông 50 lít được thực hiện tại trại sản
xuất của ông Dương Văn Minh, 36/15 Phạm Văn Đồng, TP Nha Trang.
2.1.3 Đối tượng nghiên cứu
Hình 2. 1: Quần thể tảo Thalassiosira sp.
Vi tảo Thalassiosira sp. được lấy từ phòng lưu giữ giống tảo thuộc trường Đại
học Nha Trang. Giống này được nhập từ Đan Mạch năm 2008.
2. 2. Phương pháp nghiên cứu
Hình 2. 2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 2.2.2. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm.
2.2.2.1. Nguồn nước
Tảo giống Thalassiosira sp.
Thí nghiệmảnh hưởng của độ mặn (ppt) (15, 20, 25, 30, 35)
Độ mặn thích hợp
Thí nghiệmảnh hưởng của mật độ̣ ban đầu (vạn tb/ml) (1, 5, 10, 15, 20)
Mật độ ban đầu thích hợp
Thí nghiệmảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (TT3, F2, HBM - 95)
Môi trường dinh dưỡng thích hợp
Thí nghiệmảnh hưởng của cường độ ánh sáng (lux) (1500, 2500, 3500, 4500, 5500)
Cường độ ánh sáng thích hợp
Áp dụng kết quả trên thử nghiệm nuôi sinh khối ngoài trờị
Kết luận và đề xuất ý kiến
Nước được sử dụng cho việc lưu giữ giống và các thí nghiệm trong bình tam giác
(nước ngọt và nước ót) được tiệc trùng bằng autoclave ở 121oC; 1,5 at trong 2 giờ. Sau
đó pha độ mặn theo nhu cầụ
Nguồn nước để nuôi sinh khối được lấy từ biển và xử lý chlorine 25ppm, đậy bạt
kín 24h, sục khí và phơi nắng, sau đó bơm lên để lọc cát.
2.2.2.2. Vệ sinh các dụng cụ nuôi
Các dụng cụ bằng thủy tinh như ống nghiệm (có nút bông), đĩa peptri, bình tam giác có nút bông (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), pipet …sau khi được cọ, rửa
sạch bằng xà phòng, phơi khô đều được tiệc trùng trong tủ sấy khô ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút.
Các dung dịch hóa chất, nước ót, nước cất…trước khi cấy tảo đều phải qua tiệt
trùng trong tủ sấy ướt ở 121o C trong 2 giờ
2.2.3. Các loại môi trường dinh dưỡng sử dụng trong thí nghiệm. 2.2.3.1. Môi trường F2 (Guillard, 1975) [33] 2.2.3.1. Môi trường F2 (Guillard, 1975) [33]
KNO3 89,6mg/l KH2PO4 5,6mg/l NaSiO3. 9H2O 30mg/l Na2EDTA 4,36mg/l FeCl3. 6H2O 3,15mg/l CuSO4. 56H2O 0,01mg/l ZnSO4. 6H2O 0,022mg/l CoCl3. 6H2O 0,01mg/l MnCl2. 6H2O 0,18mg/l MaMoO4. 6H2O 0,006mg/l Vitamin : Thianin (B1) 0,1mg/l (B6) 0,0005mg/l Riboflavin (B12) 0,0005mg/l 2.2.3.2. Môi trường TT3 KNO3 70mg/l KH2PO4 6mg/l Na2SiO3. 9H2O 5mg/l EDTA 5mg/l
Acid citric C6H8O7. H2O 7mg/l FeCl3. 6H2O 2mg/l 2.2.3.3. Môi trường HBM-95 [7] - Dung dịch 1: KNO3: 30 mg/l KH2PO4: 10 mg/l Na2EDTA: 10 mg/l - Dung dịch 2: Na2SiO3. 9 H2O: 10 mg/l - Dung dịch 3: FeCl3. 6H2O: 5 mg/l 2.2.4. Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Các thí nghiệm ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của tảo Thalassiosira sp.
Các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml với 4 thí nghiệm về
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo
Thalassiosira sp. nhập nộị
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển tảo
Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí 6 lô thí nghiệm tương ứng với các mức độ mặn: 10,15, 20,
25, 30, 35ppt. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
MĐBĐ: 10 x 104 tb/ml
Môi trường nuôi: F2
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa).
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của mật độ tảo ban đầu lên sự phát triển
tảo Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí 6 lô thí nghiệm tương ứng với các mật độ: 5 x104 ; 10 x 104 ; 15 x 104 ; 20 x 104 ; 30 x 104 ; 40 x 104 tb/ml. Các lô thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa) Môi trường nuôi: F2
Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự phát
Thí nghiệm được tiến hành với 3 môi trường nuôi (TT3, F2, HBM - 95), 3 lần lặp lạị Điều kiện nuôi: CĐAS: 3000 – 4000 LUX
Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
MĐBĐ: Rút ra từ thí nghiệm về mật độ ban đầu. Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa).
* Thí nghiệm: Thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự phát triển tảo
Thalassiosira sp.
Thí nghiệm được bố trí ở các mức cường độ ánh sáng như sau: 1500, 2500, 3500, 4500, 5000 lux. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Điều kiện nuôi: MĐBĐ: Rút ra từ thí nghiệm về mật độ ban đầu. Độ mặn: Rút ra từ thí nghiệm về độ mặn.
Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng (có máy điều hòa)
Môi trường dinh dưỡng : Rút ra từ thí nghiệm về dinh dưỡng.
2.2.4.2. Lưu giữ giống tảo Thalassiosira sp.
* Thí nghiệm:Lưu giữ Thalassiosira sp. trong môi trường nuôi lỏng
Bảng 2. 1. Các thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp đối với tảo Thalassiosira sp. trong dịch nuôi lỏng.
Lô thí nghiệm Điều kiện
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Môi trường dinh dưỡng HBM -
95
HBM - 95 F2 F2 TT3 TT3
Nhiệt độ 7-80C 150C 7-80C 150C 7-80C 150C
Ghi chú: Mật độ tảo lưu giữ: 30 x vạn tb/ml, 50ml/1 ống nghiệm. Độ mặn: 30ppt. Thời gian lưu giữ: 2 tuần
* Thí nghiệm: Lưu giữ Thalassiosira sp. trong môi trường nuôi bán lỏng
Bảng 2. 2. Các thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp đối với tảo Thalassiosira sp. trong dịch nuôi bán lỏng.
Lô thí nghiệm Điều kiện
Lô 7 Lô 8 Lô 9 Lô 10 Lô 11 Lô 12 Môi trường dinh dưỡng HBM -
95
HBM - 95 F2 F2 TT3 TT3
Ghi chú: Mật độ tảo lưu giữ: 30 x vạn tb/ml, 50ml/1 ống nghiệm. Độ mặn: 30ppt.
Thời gian lưu giữ: 2 tuần
Sau 2 tuần lưu giữ, tiến hành nuôi sinh khối ở các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, với mật độ ban đầu: 2 x vạn tb/ml
Môi trường dinh dưỡng: HBM-95 hoặc F2, TT3 (tương ứng với môi trường dinh dưỡng được dùng khi lưu giữ tảo)
Độ mặn: 30 ppt
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng
Chỉ tiêu xác định: môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp cho loàị Ngoài ra còn xác định dịch nuôi lỏng, bán lỏng có phù hợp để lưu giữ Thalassiosira
sp. không.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Tảo giống thuần chủng
Lưu giữ trong các điều kiện
khác nhau Môi trường lỏng (dịch nuôi lỏng) Môi trường bán lỏng (dịch nuôi lỏng và agar) MTĐ F2 ở nhiệt độ 15oC MTĐ F2 ở nhiệt độ 7 -8oC MTĐ TT3 ở nhiệt độ 15oC MTĐ TT3 ở nhiệt độ 7 -8oC MTĐ HBM ở nhiệt độ 15oC MTĐ HBM ở nhiệt độ 7 -8oC
Hình 2. 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm lưu giữ tảo giống Thalassiosira sp.
2.2.4.3. Các thí nghiệm nuôi thu sinh khối ngoài trờị
* Thí nghiệm: Nuôi sinh khối thu toàn bộ (batch culture) tảo Thalassiosira sp.
Ứng dụng các kết quả đạt được ở mục 2.2.4.1 để nuôi thu sinh khối giống tảo
Thalassiosira sp. Thí nghiệm được tiến hành trong túi nilon 50 lít trong suốt.
Điều kiện nuôi:
- Nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên
- Môi trường dinh dưỡng, độ mặn, mật độ ban đầu ứng dụng mục ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển quần thể tảo Thalassiosira sp.
- Muối dinh dưỡng được cho vào nước nuôi chỉ một lần/đợt (1ml dung dịch
muối dinh dưỡng/1 lít nước nuôi).
- Thời điểm thu hoạch: Cuối pha logarit đầu pha gia tốc âm
* Thí nghiệm: Nuôi sinh khối thu từng phần (Semi-continous culture) tảo
Thalassiosira sp.
Điều kiện nuôi:
- Nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên
- Môi trường dinh dưỡng, độ mặn, mật độ ban đầu ứng dụng mục ảnh hưởng một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển quần thể tảo Thalassiosira sp.
- Cuối pha logait, đầu pha gia tốc âm tiến hành thu hoạch theo các thể tích
20%, 40%, 60% (theo từng lô) so với thể tích thí nghiệm. Thể tích nước được bổ sung đúng bằng thể tích thu hoạch. Muối dinh dưỡng cũng được bổ sung theo thể tích thu hoạch (1ml dung dịch muối dinh dưỡng/1 lít nước bổ sung).
- Thu hoạch ở 3 tỷ lệ: 20%, 40%, 60%
Kiểm chứng: Nhân sinh khối, kiểm tra số lượng và sự phát
triển (tốc độ sinh trưởng - µ) của vi tảo
Điều kiện lưu giữ thíchhợp cho tảo
Thalassiosira sp Thí nghiệmlưu giữ trong thời
Hình 2. 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi thu sinh khối tảo Thalassiosira sp.
2.2.5. Phương pháp xác định các chỉ tiêu
2.2.5.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Việc xác định số lượng tế bào tảo được tiến hành bằng cách đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu Neubauer, buồng đếm có 9 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô
vuông nhỏ, mỗi ô vông nhỏ có diện tích 0.1mm2 và độ sâu buồng đếm là 0.1 mm.
Phương pháp lấy mẫu tảo:
- Mẫu tảo được lấy một lần trong ngày vào 8 giờ sáng để đếm mật độ tế bàọ
- Lượng mẫu tảo được lấy là 5ml/lần.
Phương pháp đếm tế bào tảo:
Giống tảo Thalassiosira sp.
Ánh sáng tự nhiên
Nhiệt độ tự nhiên
Môi trường dinh dưỡng thích hợp Nước đã xử lý Độ mặn thích hợp Sục khí 24/24h Mật độ ban đầu thích hợp Túi ni lông 50 lít
Thu hoạch tại thời điểm cuối pha logarit đầu pha gia tốc âm
Các thông số đánh giá: mật độ tế bào, tốc độ sinh trưởng, sản lượng.
Lắc đều mẫu tảo, dùng pipet paster hút mẫu tảo xịt vào buồng đếm đã được đậy
sẵn lamen, để lắng một lúc rồi đưa vào thị trường kính để đếm, đếm ở vật kính 40, mỗi mẫu tảo được đếm 3 lần.
Công thức tính mật độ tế bào tảo:
Nếu mật độ tảo thưa (dưới 500 vạn tb/ml) thì:
Mật độ tế bào (tb/ml) = số tế bào đếm được trong 4 ô lớn/4 x vạn tb
Nếu mật độ tế bào dày (trên 500 vạn tb/ml) thì:
Mật độ tế bào (tb/ml) = số tế bào đếm được trong 5 ô lớn/5 x vạn tb
Công thức tính tốc độ tăng trưởng của tảo [4]
µ = ln (N1 /N0) /t
Trong đó : µ: Tốc độ tăng trưởng.