Fusarium oxysporum ựến cây cẩm chướng
Nấm Fusarium oxysporum dianthi là loài gây hại cho các vùng trồng hoa cẩm chướng ở Italy, Israel, Colombia, Hà Lan, Nhật Bản,Ầ(Annalisa và cộng sự, 1999) [15].
Trên cây hoa cẩm chướng, tác nhân gây bệnh héo rũ bao gồm nhiều loại nấm thuộc loài Fusarium.sp như: nấm Fusarium oxysporum dian, nấm Fusarium avennaceum, nấm Fusarium poace nấm Fusarium graminearum. Với mỗi loại nấm thì chúng gây hại trên các bộ phận với dấu hiệu và triệu chứng khác nhau. Nấm Fusarium avennaceum làm héo và rụng ở nách cây, thối ựọt và nhánh bị cắt của những cây già, nấm Fusarium graminearum làm mục thân, héo ựọt với biểu hiện là các sọc ựỏ tắa dọc theo thân, nấm Fusarium poace làm búp hoa có màu nâu úa, thối, cánh hoa nở không ựều nhau (Hiệp hội hoa đà Lạt). Nấm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 17 Nấm Fusarium oxysporum phân bố ựa số trên các ựới khắ hậu, chúng có khả năng thay ựổi tắnh biến dị về ựặc ựiểm hình thái và sinh lý do sự khác nhau về ựiều kiện tự nhiên của từng vùng (Burges và cộng sự, 1999) [17].
Trên thế giới và ở Việt Nam ựã có những công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm Fusarium oxysporum ựến cây cẩm chướng:
- Kiểm soát Fusarium oxysporum f. sp. dianthi qua việc khử trùng ựất bằng việc bổ sung một lượng nhỏ metan natri và methyl bromide. Bệnh quan trọng nhất ựối với cây cẩm chướng vẫn là bệnh do nấm Fusarium oxysporum f. sp. dianthi gây nên. Bài viết này so sánh việc xông hơi khử trùng ựất truyền thống với methyl bromide ựược ựề nghị (70 g /m2) và việc bổ sung methyl bromide (14 g/m2, 28 g/m2) hoặc metam natri (35 g/m2, 70 g/m2) trong ựất bị nhiễm
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Tập trung vào khử trùng ựất, ựặc biệt với liều cao methyl bromide, ựồng thời sử dụng giống chống chịu hoặc kháng nấm ựã cải thiện ựược ựáng kể việc chống chịu nấm bệnh của cây trồng [37].
Garibaldi và Denmik ựã xác ựịnh ựược hai chủng nấm Fusarium oxysporum.sp gây hại cho cây cẩm chướng phổ biến ở Italia và một số khu vực của châu Âu. Chúng là tác nhân gây hại nhất trong ựất ựối với cây cẩm chướng. Chúng làm tác mạch dẫn của cây và gây bệnh héo Fusarium (Garibaldi, 1977; 1983; Denmik et al., 1989) [19].
Tác giả Wenner và Irzykowska ựã sử dụng kỹ thuật RAPD phân tắch tắnh ựa hình và ựã phân biệt ựược các chủng nấm Fusarium oxysporum gây hại trên cây hoa cẩm chướng (Wenner và Irzykowska, 2007) [31].
đã chuyển ựược gen chỉ thị của Fusarium oxysporum.f.sp.dianthi với hệ thống GFP và DsRedFP vào cây cẩm chướng ựể phát hiện ựược sự tồn tại của chúng trong mạch dẫn (Sarrocco và cộng sự, 2007) [29].
Thakur và cộng sự ựã tiến hành nuôi cấy và tái sinh thành công cẩm chướng trên môi trường có nấm Fusarium oxysporum.f.sp.dianthi trong ựiều kiện in vitro: Callus của cẩm chướng ựược nuôi cấy trong môi trường MS + 0,5mg/l
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 18 NAA + 0,5 mg/l 2,4-D và bổ sung 0%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5% và 20% (v/v) trong 25 ngày với nhiệt ựộ 23 -27oC. Kết quả, ở nồng ựộ 15%v/v trở lên thấy xuất hiện có callus màu xanh và các callus màu vàng xuất hiện ở nồng ựộ 15%v/v trở lên. Ở nồng ựộ 20%v/v chỉ có một vài callus sống sót. Tiến hành nuôi cấy và chọn lọc tiếp ở các chu kỳ tiếp theo (hơn 2 chu kỳ với 25 ngày/chu kỳ). Các callus sống sót ựược nuôi cấy trên môi trường tái sinh sau ựó ựược chuyển ra kiểm chứng trong ựiều kiện in vivo (Thakur và cộng sự, 2002) [23]..
Mercuri và cộng sự ựã tiến hành nuôi cấy hạt phấn của 8 loại hoa cẩm chướng trên môi trường nảy mầm bổ sung dịch nấm ở các nồng ựộ 0%, 7,5%, 15%, 30% và cho thấy rằng sàng lọc các giống kháng thông qua khảo nghiệm phấn hoa thu ựược kết quả rất khả thi (Mercuri và cộng sự) .
Mosquera và cộng sự ựã tiến hành tuyển chọn giống kháng nấm Fusarium oxysporum.f.sp.dianthi bằng cách ựồng nhất lá cẩm chướng và dịch nấm ựã ựược nuôi cấy trong 7 ngày, sau ựó bổ sung vào môi trường tái sinh với nồng ựộ từ 0% ựến 40%v/v rồi hấp vô trùng. Sau ựó tiến hành nuôi cấy và thu ựược kết quả: Ở nồng ựộ cao nhất, không có sự cảm ứng callus và tái sinh cây con. Ở các nồng ựộ còn lại, có ựến 10% callus cảm ứng và 5% cây con tái sinh. Những cây con này có ựặc ựiểm hình thái và sinh lý vắ dụ như sức sống và khả năng tái sinh rất nhanh (Mosquera và cộng sự) [26].
Các nhà nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia Pháp (INRA) ựã phát triển một phương pháp sinh học ựể kiểm soát các chủng gây bệnh của Fusarium oxysporum. Fusarium oxysporum là một loại nấm phổ biến mà ựược tìm thấy trong các loại ựất trên toàn thế giới. Một trong số nhiều chủng của nó là gây bệnh, trong khi những chủng khác là không gây bệnh và có thể bảo vệ thực vật chống lại nhiễm trùng do một chủng gây bệnh. Hiện tượng bảo vệ này ựã ựược biết ựến trong nhiều năm, và bây giờ các nhà khoa học ựã cô lập một chủng gọi là Fo47 mà cung cấp sự bảo vệ ựặc biệt hiệu quả [36].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 19 Tác giả đoàn Thị Thanh ựã tiến hành phân tắch ựa dạng di truyền gen ựối với các loài nấm Fusarium của Việt Nam và các nước khác thông qua việc sử dụng kắ thuật PCR và nhân bản DNA. Kết quả chuẩn ựoán ựược 4 loài nấm
Fusarium.sp như: Fusarium oxysporum.f.sp.arpense trên chuối ở Việt Nam,
Fusarium moniliforum ở hành ta, cỏ ựinh lăng ở Việt Nam, Ai Cập, Hàn Quốc, nòi Fusarium solani ở trên cây khoai tây, cà chua ở 3 nước trên và Fusarium avanaceum ở Hàn Quốc [12].
Khi nghiên cứu về khả năng sinh enzyme ngoại bào: amylase, protease, cellulose từ nấm Fusarium Nguyễn Thị Hương Giang ựã xác ựịnh: Trong khoảng 4 ựến 5 ngày nuôi cấy lượng enzyme amylase, protease, cellulose ựược sinh ra nhiều nhất. Hiệu số ựường kắnh vòng phân giải ựo ựược lớn nhất vào ngày thứ tư, enzyme cellulase là 14 mm, enzyme amylase là 14.5 mm, thấp nhất là enzyme protease với 6mm [5].
KS. Bùi Thị Thanh Quyên ựã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm bệnh Fusarium oxysporum ựến khả năng sống sinh trưởng của một số dòng cẩm chướng ựã xử lý ựột biến bằng tia gamma trong ựiều kiện in vitro và ựạt ựược kết quả: ựã phân lập, làm thuần thành công ựược chủng nấm bệnh
Fusarium oxysporum từ cây cẩm chướng; xác ựịnh ựược dịch nuôi cấy nấm
Fusarium oxysporum có ảnh hưởng ựến khả năng sống và sinh trưởng của các dòng cẩm chướng nghiên cứu và xác ựịnh ựược ngưỡng LD50 của cây cẩm chướng in vitro là khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 30%v/v dịch nuôi cấy nấm Fusariumoxysporum [9].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20
PHẦN III
đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu
đoạn thân mang mắt ngủ của các cây cẩm chướng in vitro
3.1.2 đối tượng nghiên cứu
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên các dòng cẩm chướng ựã ựược xử lý ựột biến E1, E16, Sp5 và giống đỏ.
Các dòng ựột biến ựược xử lý ựột biến như sau: + Dòng E1: QC EMS 1h-0,4% + Dòng E16: đỏ EMS 3h-0,6% + Dòng SP5: đỏ EMS 1h-0,6% Giống đỏ Dòng E16 Dòng E1 Dòng Sp5
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
3.1.3 địa ựiểm nghiên cứu
- Phòng nuôi cấy mô và phòng sinh học phân tử của Viện Công nghệ sinh học - đại học Nông nghiệp Hà Nội
- Khu thắ nghiệm của khoa Công nghệ sinh học Ờ đại học Nông nghiệp Hà Nội
3.1.4 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2011 Ờ tháng 4/2012
3.2. Nội dung nghiên cứu
Thắ nghiệm 1: Nuôi cấy và tách chiết ựược dịch nấm Fusarium oxysporum
gây bệnh trên cây cẩm chướng
Nuôi cấy mẫu nấm Fusarium oxysporum ựã ựược phân lập và làm thuần trên môi trường PDA ựặc ựể hoạt hoá tăng khối lượng, sau ựó ựể tiến hành nuôi cấy chúng trong môi trường PDA lỏng ựể tăng sinh khối. Sau khoảng 7 Ờ 10 ngày tiến hành lọc dịch ựể thu dịch chiết.
Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum
ựến khả năng sống, sinh trưởng in vitro của các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu
Mỗi dòng, giống ựược tiến hành nuôi cấy trên môi trường có bổ sung dịch nấm bệnh Fusarium oxysporum ở các nồng ựộ khác nhau trong 2 chu kỳ:
- Chu kỳ I
Chu kỳ 1 ựược bố trắ như sau:
Nền môi trường là môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza, pH = 5,8 .
CT1: Môi trường nền.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22 CT3: Môi trường nền + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
CT4: Môi trường nền + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
2. Chu kỳ II
Cây sống của các dòng, giống cẩm chướng ở chu kỳ I sau khi ựược phục hồi qua môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza, pH = 6,2 ựược tiếp tục nuôi cấy chu kỳ II trên các môi trường sau:
CT1: Môi trường nền.
CT2: Cây sống CT2 chu kì I + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
CT3: Cây sống CT2 chu kì I + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
CT4: Cây sống CT2 chu kì I + 45% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum ựến khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng nghiên cứu
Cây sống của các dòng, giống cẩm chướng ở chu kỳ 2 sau khi ựược nuôi cấy phục hồi qua môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar và 30g/l saccaroza, chuẩn pH = 6,2 thì sẽ chuyển nuôi cấy trên môi trường ra rễ có bổ sung 30% dịch nấm. Thắ nghiệm ựược bố trắ như sau:
Nền môi trường là môi trường MS bổ sung 6,2g/l agar, 30g/l saccaroza , 0,5g/l than hoạt tắnh và 0,5 mg/l α-NAA, pH = 6,2.
CT1: Môi trường nền.
CT2: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
CT3: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
CT4: Cây sống CT2 chu kì II + 30% v/v dịch nấm Fusarium oxysporum.
Kết thúc thắ nghiệm 3 sẽ phân lập ựược mẫu cẩm chướng có khả năng chống chịu nấm Fusarium oxysporum trong ựiều kiện in vitro.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
Thắ nghiệm 4: đánh giá khả năng chống chịu nấm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo
Sử dụng mẫu cẩm chướng ựã ựược nuôi cấy sau thắ nghiệm 3 trồng trong vườn ươm và lây nhiễm nhân tạo nấm bệnh ựể ựánh giá khả năng chống chịu của các dòng
Công thức thắ nghiệm:
CT1: Không bổ sung dịch bào tử nấm vào giá thể trồng cây
CT2: Bổ sung dịch bào tử nấm vào giá thể trồng cây
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum
Nấm Fusarium oxysporum ựã phân lập ựược cấy chuyển vào môi trường thạch PDA nuôi trong ựiều kiện tối ở nhiệt ựộ 25 Ờ 30oC. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu nấm ựược cấy chuyển sang môi trường PDA lỏng. Các thao tác ựược tiến hành trong ựiều kiện vô trùng. Bình môi trường PDA lỏng chứa nấm Fusarium oxysporum ựược nuôi lỏng lắc 150 vòng/phút trong ựiều kiện tối ở 25 Ờ 30oC. Sau 5 -7 ngày nuôi cấy tùy theo ựiều kiện nhiệt ựộ nuôi cấy, thì tiến hành lọc dịch nấm.
Mẫu nấm nghiên cứu ựược lọc theo các bước sau:
Bước 1: Lọc sơ bộ
- Toàn bộ dịch nuôi cấy bao gồm cả xác nấm Fusarium oxysporum ựược lọc 2 lần qua màng gồm 3 lớp vải màn xếp chồng lên nhau. Thu lấy dịch lọc, loại bỏ phần cặn bã.
- Toàn bộ dịch lọc ựược lọc 2 lần qua màng lọc giấy Walkman hoặc ựem quay li tâm 15000 vòng trong 5 phút sau ựó thu lấy dịch lọc, loại bỏ cặn bã.
Bước 2: Thu dịch nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum vô trùng Minisart kắch thước 0.2 ộm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 - Dịch lọc thu ựược từ bước lọc sơ bộ ựược lọc qua màng lọc vô trùng Minisart kắch thước 0.2 ộm trong ựiều kiện vô trùng. Thu lấy dịch nuôi cấy nấm
Fusarium oxysporum vô trùng.
Thành phần các môi trường nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum
Môi trường Thành phần đặc ựiểm
PDA
− Khoai tây: 250g/l
− Dextrose: 20g/l
− Agar: 20g/l
− pH: 5,7 ổ 0,1
Môi trường giàu dinh dưỡng giúp nấm phát triển mạnh hệ sợi. PDA lỏng − Khoai tây: 250g/l − − − − Dextrose: 20g/l − pH: 5,7 ổ 0,1
Môi trường giàu dinh dưỡng dùng ựể nuôi cấy lấy dịch lọc nấm Fusarium oxyspoum
CLA −
Agar : 20g/l
− Lá cẩm chướng khô
Môi trường nghèo dinh dưỡng ựể nấm mọc bào tử.
Phương pháp giữ giống
Môi trường giữ giống: Môi trường PDA
Cấy khuẩn lạc của chủng nấm Fusarium oxysporum ựã phân lập dựa vào môi trường PDA trong các ựĩa petri sau ựó dán giấy parapin rồi gối vào giấy báo và ựể trong tủ ựịnh ôn 28 Ờ 300C trong khoảng 4,5 ngày sau ựó bảo quản trong tủ lạnh
Giữ giống trong dung dịch gkyxeron: Dùng pipet hút dịch nấm ựã ựược nuôi trong môi trường dịch thể lỏng trong khoảng 3 ngày hút 500ộm dịch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 glyxerol cho vào ống efpendol 1000ộm bảo quản trong tủ lạnh ở 00C sau 1 ngày, rồi chuyển sang tủ lạnh Ờ 300C ựể khoảng 1 Ờ 2 ngày, cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh sâu Ờ 800C.
3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô hiện hành
- Môi trường cơ bản: MS (Muarahige & Skoog, 1963 với 6,2 g/l agar, 30 g/l sacarose và 100 mg/l innositot), pH = 5.8 Ờ 6.0
- Môi trường ựược hấp khử trùng ở nhiệt ựộ 1210C trong 20 phút.
- điều kiện thắ nghiệm: các thắ nghiệm ựược tiến hành trong ựiều kiện nhân tạo, ựiều kiện ánh sáng, nhiệt ựộ, ựộ ẩm luôn ựược giữ ổn ựịnh;
+ Cường ựộ ánh sáng: 2000 Lux
+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối + độ ẩm: 70% - 80%
+ Nhiệt ựộ: 20 Ờ 220C
3.3.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Nấm Fusarium oxysporum ựược phân lập, làm thuần ựược nuôi cấy trên môi trường CLA ựể nhân bào tử.
* Môi trường CLA:
- Agar: 20 g
- Lá cẩm chướng: 4 Ờ 5 mẫu
- Nước cất: 1 l
- Phương pháp ựiều chế: Lá cẩm chướng ựược lấy từ cây cẩm chướng sạch bệnh, cắt thành từng mẩu 5 Ờ 8 mm và sấy ở nhiệt ựộ 300C trong 3 Ờ 9 giờ (ựến khi khô giòn). Những mẫu lá cẩm chướng này ựược ựựng trong hộp nhựa và hấp khử trùng ở 1200C, 1.4 atm, trong vòng 40 phút. Môi trường thạch 0.2% cũng ựược hấp khử trùng ở 1200C, 1.4 atm, trong vòng 40 phút. Môi trường ựược khử
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 trùng ựể nguội dần ựến 60 -700C rồi ựổ ra các ựĩa petri nhỏ (ựường kắnh 6cm) ựã có chứa sẵn 4 -5 mẫu lá cẩm chướng khô, bố trắ mỗi ựĩa sao cho lá cẩm chướng dồn vào xung quanh ựĩa và nổi lên trên bề mặt thạch
Các mẫu nấm sau khi ựược cấy trên môi trường CLA ựể phát sinh bào tử ựược ựặt trong tủ ựịnh ôn 28 Ờ 300C, trong thời gian 10 ngày. Khi soi thấy bào tử ựã mọc kắn bề mặt ựĩa thì pha loãng với dung dịch huyền phù.
- Dung dịch huyền phù: 0.5 g Agar + 1l nước cất. Dung dịch cũng ựược hấp khử trùng ở nhiệt ựộ 1200C, 1.4 atm, trong 40 phút.
- Pha loãng dung dịch huyền phù với 10 ựĩa petri nuôi cấy bào tử nấm với