- Rau xanh (lá rau mồng tơi hay rau muống) - Aceton P.A - Eter dầu mỏ (Đs. 30 60 0) - Na2SO4 khan - Nước cất - Kéo inox - Máy đồng thể hóa - Phễu chiết 125 mL - Phễu lọc Ф6 - Phễu lọc Ф4 - Pipet Pasteur - Ống nghiệm nút vặn 18 mL - Lọ nhỏ đựng mẫu 4 mL - Bản mỏng Silicagel - Ống đong 10; 20 mL - Bút chì, thước kẽ vạch millimet (sinh viên tự mang theo)
- Kẹp inox nhỏ (kẹp bản mỏng) - Cốc nhỏ 100 mL và nắp đậy - Mao quản sắc ký - Giấy nhôm - Tủ Hotte III.Tiến hành : Phần 1. Chiết và tinh chế sắc tố
- Bước 1: Cân khoảng 1,0 gam rau xanh. Dùng kéo để cắt rau thành những mẫu nhỏ rồi cho vào cốc có mỏ 50 mL (hoặc ống thủy tinh thành cao).
- Bước 2: Thêm 20 mL aceton vào cốc chứa mẫu. Đồng hóa mẫu trong khoảng 2 phút. Để lắng, gạn và lọc dịch chiết bên trên (có màu xanh lục) qua phễu lọc Ф6 (có nhồi sẵn một ít bông hút nước ở dưới cuống phễu) được đặt trên một phễu 125 mL.
- Bước 3: Thêm 5 mL eter dầu mỏ vào phễu chiết chứa dịch chiết aceton, lắc đều. Sau đó, thêm khoảng 20 ml nước cất (cho nước cất chảy từ từ dọc theo thành phễu chiết), đảo nhẹ phễu. Để yên hỗn hợp cho đến khi thấy tách thành 2 lớp rõ rệt.
- Bước 4: Mở khóa phễu chiết để tách bỏ hết lớp aceton- nước (lớp dưới). Lọc lấy dịch chiết sắc tố trong pha eter dầu mỏ (lớp trên) qua một lớp Na2SO4 khan (chứa trong trong phễu
- 48 -
lọc Ф4, bên dưới cuống phễu có nhồi sẵn một ít bông hút nước) rồi hứng vào ống nghiệm nút vặn. Dùng pipet Pasteur hút một ít eter dầu mỏ và tráng rửa hết lượng chất màu còn bám vào lớp Na2SO4 và gộp chung vào dịch lọc trong ống nghiệm trên. Vặn chặt nắp ống nghiệm, bọc bằng giấy nhôm, để thực hiện tiếp phần 2 của bài thực hành.
Phần 2. Phân tách hỗn hợp sắc tố bằng phương pháp sắc ký bản mỏng
Hình 1. Đánh dấu tuyến xuất phát và tuyến dung môi
- Bước 1 (Chuẩn bị bản mỏng): Bản mỏng silicagel kích thước 5 cm x 2 cm được dùng để phân tách hỗn hợp sắc tố. Dùng bút chì (không được dùng bút bi, bút mực, …) và thước kẽ để đánh dấu tuyến xuất phát (cách mép dưới bản 5 mm), tuyến dung môi (cách mép trên bản 3 mm) và điểm chấm mẫu (cách bờ dọc 1 cm) (xem hình 1, trang 24)
- Bước 2 (Chuẩn bị buồng sắc ký) : Dùng ống đong 10 ml để chuẩn bị 10 mL pha động chứa hỗn hợp eter dầu mỏ- aceton 80: 20 (v/v). Chuẩn bị buồng sắc ký bằng cách cho khoảng 3 mL pha động vào một cốc thủy tinh cỡ 50 - 100 mL. Cắt một tờ giấy lọc thấm dung môi pha động và ép chặt vào thành cốc. Dùng mặt kính đồng hồ (hay đĩa petri) đậy cốc lại, để yên cho pha động bão hòa trong buồng sắc ký.
- Bước 3 (Chấm mẫu sắc ký): Dùng 1 mao quản sạch (hay pipet Pasteur có đầu vuốt thật nhỏ) nhúng vào dịch chiết cô đặc (đã chuẩn bị ở Bước 4 - Phần 1) rồi chấm vào điểm chấm mẫu (ở giữa tuyến xuất phát) sao cho tạo thành một vết tròn, gọn. Nếu mẫu loãng (vết chất có màu nhạt) thì chấm tiếp 2-3 lần nữa dịch chiết lên bảng mỏng cũng ngay tại vết chấm mẫu lần trước.
- Bước 4 (Triển khai sắc ký): Dùng kẹp inox chuyển bản mỏng đã chấm mẫu vào buồng sắc ký. Chú ý không được để bản mỏng chạm vào giấy lọc trong cốc. Đậy nắp buồng sắc ký lại, để yên và quan sát. Khi thấy dung môi di chuyển đến vị trí tuyến dung môi đã đánh dấu thì nhanh chóng dùng kẹp gắp bản mỏng ra.
- Bước 5 (Nhận biết các vết sắc tố): Ngay khi dung môi trên bản vừa khô, dùng bút chì đánh dấu vị trí và ghi rõ màu sắc của các vết sắc tố được tách ra. Tính giá trị Rf của các vết hợp chất này. Nhận biết các nhóm sắc tố dựa theo thứ tự giảm dần Rf như sau:
Các caroten: 1 vết (vàng – cam)
Pheophytina: màu xám, đậm gần bằng màu của chlorophyll b
3 mm
5 mm
Tuyến dung môi
Tuyến xuất phát
- 49 -
Pheophytinb: màu xám, có thể không rõ
Chlorophyla: màu lục lam, đậm hơn màu của chlorophyll b Chlorophyllb: màu lục
Các xanthophyll: có thể có 3 vết (màu vàng)
Chấm mẫu sắc ký Triển khai sắc ký